血漿中丙型肝炎病毒核酸在不同保存條件下的穩定性*

劉悅越，高加梅，范行良，杜加亮，劉 艷，國 泰

△(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

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·論 著·

血漿中丙型肝炎病毒核酸在不同保存條件下的穩定性*

劉悅越，高加梅#，范行良，杜加亮，劉 艷，國 泰

△(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 探討不同保存條件和時間對丙型肝炎病毒(HCV)RNA穩定性的影響。方法 將22份血漿樣本置于-20 ℃保存4周，4 ℃保存12 d，室溫(20～25 ℃)保存7 d，反復凍融5次，采用熒光定量聚合酶鏈反應測定HCV RNA水平，考察HCV RNA穩定性。結果 樣本在-20 ℃保存4周HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14 lg，±95%CI≤0.20 lg；4 ℃保存12 d HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39 lg，4 ℃保存12 d時95%CI下限為-0.50 lg，<12 d時±95%CI≤0.24 lg；室溫保存7 d HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40 lg，室溫保存7 d處理組95%CI下限為-0.53 lg，<7 d時±95%CI≤0.29 lg；反復凍融5次HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10 lg，±95%CI≤0.15 lg。結論 血漿樣本在-20 ℃保存4周、4 ℃保存9 d、室溫保存5 d和反復凍融5次時，對HCV RNA水平影響不明顯，但4 ℃保存12 d或室溫保存7 d后，RNA水平顯著降低，所以應避免在這種條件和時間下保存和運輸血漿。

丙型肝炎； 核酸； 穩定性

對丙型肝炎病毒(HCV)進行核酸篩查能夠顯著縮短HCV篩查的窗口期[1]，同時，定量測定HCV RNA是臨床診斷、臨床抗病毒藥物療效評估和預后的重要指標[2]。但由于RNA不穩定，易受環境影響，因此樣本保存和處理不當會直接影響HCV篩查或核酸定量的檢出率和準確性。另一方面，HCV核酸標準品的存放條件也對其質量有影響，會進一步影響對診斷試劑的評價和試驗結果的判斷。一些研究者曾報道不同的樣本采集處理，如血清、血漿、不同抗凝劑下的抗凝全血在不同保存溫度下會影響HCV RNA的穩定性[3-4]，但其著重點在于樣本的采集處理對HCV RNA穩定性的影響。在保存溫度方面考察的時間較短，且針對HCV RNA水平較高，約為106copy/mL的強陽性樣本，由于HCV核酸標準品的標準存放條件為-70 ℃及以下，因此本研究以樣本置于-70 ℃作為對照，采用涵蓋HCV RNA水平高、中、低的血漿樣本，全面考慮樣本可能存放的溫度環境和時間，系統考察不同保存溫度在較長時間內和反復凍融對HCV RNA穩定性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 22份血漿樣本均來自獻血員，經檢測HCV RNA為陽性。

1.2 儀器與試劑 ABI7500熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀。HCV核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)[凱杰生物工程(深圳)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理 將22份HCV RNA陽性血漿樣本分別分裝于1.5 mL無菌離心管中，每管1 mL，采用不同溫度保存處理，設為處理組。將分裝好的樣本分別放置于以下條件：-20 ℃保存1、2、3、4周；4 ℃保存3、6、9、12 d；室溫(20～25 ℃)保存1、3、5、7 d；凍融處理：反復凍融1、3、5次。處理完成后，放入-70 ℃凍存，等待統一檢測，并以分裝后即刻放入-70 ℃凍存的樣本作為對照組。

1.3.2 HCV RNA水平測定 采用凱杰生物工程(深圳)有限公司的HCV核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行核酸提取和PCR擴增檢測。核酸提取：按照試劑盒說明提取核酸。同時設HCV陰性對照品、HCV臨界陽性對照品、HCV強陽性對照品。向1.5 mL的滅菌離心管中分別加入25 μL蛋白酶溶液。并加入待測樣本200 μL和新鮮配制的裂解液，蓋上蓋子，振蕩15 s，充分混勻，于56 ℃溫浴15 min。加入250 μL無水乙醇，蓋上蓋子，徹底混勻(振蕩15 s)。15～25 ℃下靜置5 min，轉入加套管的核酸純化柱，6 000 g離心1 min。倒掉套管中的廢液，將提取柱重新放入套管中。向核酸純化柱中加入500 μL洗液1，6 000 g離心1 min，倒掉套管中的廢液，將提取柱重新放入套管中。加入500 μL洗液2，6 000 g離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將提取柱重新放入收集管中。加入500 μL無水乙醇，6 000 g離心1 min，丟棄套管，將提取柱放入新的收集管中，20 000 g高速離心3 min，徹底去除乙醇。丟棄收集管，將核酸純化柱放入干凈的1.5 mL離心管中，打開提取柱的蓋子，56 ℃溫浴3 min，以徹底去除殘留的液體。將核酸純化柱放入另一干凈的1.5 mL離心管中，加入60 μL 洗脫液，蓋上蓋子，20～25 ℃靜置5 min。20 000 g高速離心1 min，收集濾出液，做好標記，4 ℃保存備用。提取的病毒核酸應在2 h內用于PCR擴增。PCR擴增檢測：按照試劑盒說明配置反應液，每個反應體系含有HCV RT-PCR反應液28 μL，酶混合物2 μL。取待測樣品的核酸提取物20 μL，反應總體積50 μL。擴增和檢測參數為50 ℃，30 min；95 ℃，15 min；95 ℃，15 s，50 ℃，45 s，72 ℃，15 s，熒光信號收集設在50 ℃，45個循環；反應體系50 μL。擴增檢測的結果根據設置的HCV定量標準品相應濃度由儀器軟件自動分析給出結果。

1.4 統計學處理 將樣本各處理組各時間點的檢測結果進行對數轉換，并計算均數和標準差。計算處理組與對照組的差值平均值、標準差和差值的95%置信區間(CI)。采用SPSS 19.0軟件對各組處理的結果進行Friedman檢驗，比較同一溫度下所有處理組與對照組結果差異是否有統計學意義。如差異有統計學意義，再進行各處理組與對照組結果比較，統計兩組差異是否有統計學意義，以P<0.05為差異有統計學意義。分子試驗的試驗內標準差為0.50 lg，因此如果差值或95%CI在±0.50 lg以下，即不認為核酸水平顯著降低[5-7]。

2 結 果

2.1 樣本中HCV RNA水平 本研究中22份樣本HCV RNA水平及其對數轉換值見表1。對分裝后即刻放入-70 ℃凍存的對照組樣本進行檢測，其HCV RNA水平在7.76×102～2.60×106U/mL，覆蓋高、中、低濃度，均值為1.95×105U/mL。

2.2 -20 ℃保存對血漿HCV RNA穩定性的影響 處理組與對照組差值平均值、標準差和差值的95%CI見表2。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14 lg，±95%CI≤0.20 lg。-20 ℃保存1周和2周的結果與對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，-20 ℃保存3周和4周的結果與對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)，但-20 ℃保存3周和4周之間結果差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 22份樣本HCV RNA水平

表2 -20 ℃保存不同時間的血漿HCV RNA穩定性(n=22)

注：-表示無數據。

2.3 4 ℃保存對血漿HCV RNA穩定性的影響 處理組與對照組差值平均值、標準差和差值的95%CI見表3。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39 lg，4 ℃保存12 d處理組的95%CI下限為-0.50 lg，其他處理組±95%CI≤0.24 lg。4 ℃保存3、6、9、12 d的結果與對照組之間差異均有統計學意義(P<0.05)，但4 ℃保存3、6、9 d之間結果差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 室溫保存對血漿HCV RNA穩定性的影響 處理組與對照組差值平均值、標準差和差值的95%CI見表4。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40 lg，室溫保存7 d處理組的95%CI下限為-0.53 lg，其他處理組±95%CI≤0.29 lg。室溫保存1 d的結果與對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，保存3、5、7 d的結果與對照組之間差異均有統計學意義(P<0.05)。

表3 4 ℃保存不同時間血漿HCV RNA穩定性(n=22)

注：-表示無數據。

表4 室溫保存不同時間血漿HCV RNA穩定性(n=22)

注：-表示無數據。

2.5 反復凍融對血漿HCV RNA穩定性的影響 處理組與對照組差值平均值、標準差和差值的95%CI見表5。各處理組HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10 lg，處理組±95%CI≤0.15 lg。反復凍融3次的結果與對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，但反復凍融1次和5次的結果與對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)，反復凍融1次和5次的結果之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 反復凍融的血漿HCV RNA穩定性(n=22)

注：-表示無數據。

3 討 論

HCV核酸檢測在血液篩查預防經輸血傳播丙型肝炎、臨床診斷、評價抗病毒治療效果和預后中至關重要[8]，待測樣本在保存和運輸中RNA裂解直接影響病毒的檢出，從而增加檢測結果為假陰性的可能性。因此待測樣本必須在適當條件下進行保存和運輸，以保證檢測結果的準確性和可重復性。

差異有無統計學意義僅僅是統計結論，不一定在現實中有意義，使用方法和樣本量、樣本中RNA水平分布的不同會影響結果，因此并不具有決定性作用。判斷HCV RNA水平是否顯著降低還需要結合專業知識，目前尚無行業標準，根據文獻一般認為分子試驗的試驗內標準差為0.50 lg。因此如果差值或95%CI在±0.50 lg以下，即不認為核酸水平顯著降低[5-7]。

曾有一些學者針對HCV血樣的保存進行研究。Baleriola等[5]報道樣本在-20 ℃凍存1.2年后，HCV RNA水平與對照組相比，差異有統計學意義，但降低不超過0.50 lg，認為這種RNA損失在試驗誤差范圍內，對臨床判斷的影響不大[6]。本研究結果發現，樣本在-20 ℃保存1周和2周的結果與對照組比較差異無統計學意義，-20 ℃保存3周和4周的結果與對照組比較差異有統計學意義。樣本在-20 ℃凍存1周后，與對照組相比，HCV RNA水平增加0.03 lg，這種水平升高可能是由于試驗誤差引起的；凍存2～4周后，HCV RNA水平平均有所下降，但均不超過0.14 lg，±95%CI也小于0.20 lg。

Gessoni等[7]指出，在4 ℃保存7 d的全血樣本HCV RNA水平未見顯著降低。Sener等[8]的研究表明，非抗凝樣本在4 ℃保存5周，其HCV RNA水平仍然穩定。本研究中4 ℃保存3～12 d的結果與對照組比較差異均有統計學意義，但各處理組HCV RNA平均下降幅度不超過0.39 lg，值得注意的是4 ℃保存12 d后處理組的95%CI下限為-0.50 lg，達到了人們普遍接受的分子試驗內標準差，其他處理組±95%CI不超過0.24 lg。因此，樣本在4 ℃保存12 d可能會影響RNA水平的檢測。

Grant等[9]研究表明，血漿樣本在25 ℃放置5 d，HCV RNA水平(0.20 lg)顯著降低。Comert等[6]的研究表明，室溫下放置1、2、3 d與對照組比較差異有統計學意義，但處理組與對照組的HCV RNA差值平均值不超過0.20 lg。而本研究室溫保存1 d的結果與對照組比較差異無統計學意義，保存3、6、9 d的結果與對照組之間差異均有統計學意義。各處理組HCV RNA平均下降幅度不超過0.40 lg，但室溫保存7 d處理組的95%CI下限為-0.53 lg，分子試驗內標準差其他處理組±95%CI均小于0.29 lg，說明樣本在室溫保存7 d可能會使HCV RNA水平明顯降低。

RNA保存最常用的方法是凍存,已有一些學者針對凍存對HCV RNA的影響進行了研究[10-11]。近期Baleriola等[5]報道，樣本在-70 ℃凍存9年后，HCV RNA水平與對照組相比，差異有統計學意義，但降低不超過0.50 lg，認為這種RNA損失在試驗誤差范圍內，對臨床判斷的影響不大。但是反復凍融會影響HCV RNA的穩定性。Gessoni等[7]指出，反復凍融5次后HCV RNA水平顯著降低。但Comert等[6]的研究表明，樣本經過反復凍融10次，與對照組差異仍無統計學意義。本研究中反復凍融3次的結果與對照組之間差異無統計學意義，但反復凍融1次和5次的結果與對照組之間差異有統計學意義，各處理組HCV RNA平均下降幅度不超過0.10 lg，處理組±95%CI不超過0.15 lg。

以往一些研究結果差異在一定程度上可能與樣本的選擇，如血清或血漿，乙二胺四乙酸抗凝或檸檬酸鹽抗凝等，HCVRNA檢測的方法、統計學方法、判斷標準及樣本量的不同有關。本研究選擇22份覆蓋HCVRNA高、中、低濃度的血漿樣本，通過不同的保存條件和不同的時間，可以總結出：血漿樣本在-20℃保存4周、4℃保存9d、室溫保存5 d和反復凍融5次，對HCV RNA檢測影響不明顯，但4 ℃保存12 d和室溫保存7 d后，RNA水平顯著降低，應避免在這種條件和時間下保存和運輸血漿。

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Stability of hepatitis C virus nucleic acid in plasma stored on different conditions*

LIUYue-yue，GAOJia-mei#，FANXing-liang，DUJia-liang，LIUYan，GUOTai

△(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China)

Objective To investigate effects of different storage conditions and time on stability of HCV RNA.Methods Totally 22 plasma samples were stored at different conditions as bellow:-20 ℃ for 4 weeks;4 ℃ for 12 days;room temperature(20-25 ℃) for 7 days;5 freeze-thaw cycles.HCV RNA was determined by RT-PCR to investigate the stability of it.Results The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.14 lg and ±95%CI≤0.20 lg when samples were stored at -20 ℃ for 4 weeks.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.39 lg and ±95%CI≥-0.50 lg when samples were stored at 4 ℃ for 12 days.But ±95%CI≤0.24 lg when samples were stored at 4 ℃ less than 12 days.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.40 lg and ±95%CI≥ -0.53 lg when samples were stored at room temperature for 7 days.But ±95%CI≤0.29 lg when samples were stored at room temperature less than 7 days.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.10 lg and ±95%CI≤0.15 lg when samples were frozen and thawed for 5 times.Conclusion HCV RNA is stable in plasma samples stored at -20 ℃ for 4 weeks,4 ℃ for 9 days,room temperature for 5 days or after 5 freeze-thaw cycles.But HCV RNA concentration declined dramatically when samples were stored at 4 ℃ for 12 days and room temperature for 7 days.The storage and transportation should be avoided in these conditions.

hepatitis C； nucleic acids； stability

國家科技重大專項課題資助項目(2012ZX10004702)。

劉悅越，女，碩士，助理研究員，主要從事生物制品質量研究。 # 同為第一作者。

△通訊作者,E-mail:guotai@nifdc.org.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.001

A

1672-9455(2015)03-0289-03

2014-07-04

2014-10-22)