急性髓性白血病全基因組miRNA表達譜研究*

徐 勇,林小聰,文錦麗,李 寧,張宇明,陳文標,喻祥琪,戴 勇△

(1.廣東省深圳市坪山新區人民醫院 518118;2.廣東醫學院生物化學與分子生物學研究所,廣東湛江 524023;3.廣東省深圳市人民醫院臨床醫學研究中心 518020;4.廣東醫學院附屬醫院血液科,廣東湛江 524001)

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·論 著·

急性髓性白血病全基因組miRNA表達譜研究*

徐 勇1,林小聰2,文錦麗3,李 寧4,張宇明4,陳文標3,喻祥琪3,戴 勇3△

(1.廣東省深圳市坪山新區人民醫院 518118;2.廣東醫學院生物化學與分子生物學研究所,廣東湛江 524023;3.廣東省深圳市人民醫院臨床醫學研究中心 518020;4.廣東醫學院附屬醫院血液科,廣東湛江 524001)

目的 通過比較微小RNA(miRNA)在急性髓性白血病 (AML)與對照組骨髓樣本中的表達情況，發現在AML中異常表達的miRNA。方法 提取骨髓樣本總 RNA，應用Illumina高通量測序技術對15例 AML患者(AML組)和10例骨髓象正常的貧血或發熱原因待查患者(對照組)骨髓樣本中的miRNA 表達水平進行檢測，分析比較二者miRNA表達的差異。結果 AML樣本與對照樣本間差異表達的miRNA 共307種，其中232種miRNA在AML組呈表達上調，75種miRNA呈表達下調。結論 多種miRNA 在AML患者的骨髓樣本中異常表達，提示它們可能在AML發生和發展過程中起重要調控作用。

急性髓性白血病; 微小RNA; Illumina測序; 表達譜

急性髓性白血病(AML)是一類髓系造血干/祖細胞起源的克隆增生性急性血液系統惡性腫瘤，其病死率在血液系統惡性腫瘤中居于首位[1]。AML病因復雜，發病機制尚不完全清楚，其預后在最近30年無明顯改善[2-3]。因此，迫切需要尋找新的分子靶點和治療方法。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的內源性單鏈小片段非編碼RNA分子[4]。miRNA可在轉錄水平或轉錄后水平調節基因表達，屬于廣義的表觀遺傳學范圍[5]。miRNA與AML關系密切，可能成為AML潛在的治療靶點[6-7]。目前少有通過miRNA測序技術在AML患者骨髓樣本中系統性研究miRNA表達譜的報道。因此，本文通過Illumina高通量測序技術對AML患者全基因組miRNA表達譜進行差異表達分析，為探討AML相關發病機制及尋找新型的AML治療靶點奠定良好的基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 15例AML患者的骨髓標本(AML組)來自深圳市人民醫院2012年8月至2014年2月的住院患者，其中男9例，女6例，年齡18～77歲，平均40歲。全部AML患者均符合 FAB 國際分型的診斷標準，且均為初發病例，在采樣前均未接受化療或放療。10例骨髓象正常的貧血或發熱原因待查患者的骨髓標本(對照組)收集自廣東醫學院附屬醫院2012年3月至2014年1月的住院患者，其中男6例，女4例，年齡10～73歲，平均39歲。

1.2 材料 紅細胞裂解液和乙二胺四乙酸抗凝管購自BD公司；無RNase的DNase Ⅰ為Promega公司產品；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；3′與5′ small RNA測序接頭、反轉錄引物、聚合酶鏈反應(PCR)擴增引物、TruSeq Rapid SR cluster試劑盒及TruSeq Rapid SBS試劑盒均為Illumina公司產品。

1.3 樣本采集和保存 患者行骨髓穿刺采集2 mL 骨髓樣本于乙二胺四乙酸抗凝管中，加入2 mL 細胞裂解液，混勻，靜置7 min，1 200 r/min離心4 min，棄去上層紅色上清液，收集沉淀部分；加入滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL溶解后轉移至另一滅菌1.5 mL的EP管中。1 200 r/min離心4 min，棄上清液，沉淀中加入滅菌PBS 2 mL稍微混勻，1 200 r/min離心4 min，棄上清液，收集沉淀，-80 ℃保存。

1.4 方法

1.4.1 總RNA提取 骨髓樣本的預處理是將骨髓樣品加入2 mL的TRIzol試劑，用電動勻漿器進行勻漿。然后按TRIzol說明書提取組織總RNA，并加入無RNase的DNase Ⅰ進行處理以去除基因組DNA的污染。NanoDrop ND-1000全波長紫外分光光度計在230、260及280 nm波長分別測定吸光度(A)值，計算RNA樣品的濃度并分析其純度。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.4.2 測序文庫的構建及質量評估 總RNA在T4RNA連接酶的作用下加上3′、5′ small RNA測序接頭，所得產物經RT-PCR擴增及聚丙烯胺凝膠電泳純化生成small RNAs文庫，然后通過Agilent 2000 Bioanalyzer對文庫進行定量和質量分析。以片段長度峰值在130～155 nt且定量大于或等于1 fmol為文庫質量完好，可用于測序文庫的簇生成及Illumina測序分析。

1.4.3 DNA簇生成和Illumina測序 將small RNAs文庫樣品稀釋至8 pmol，使用Illumina cBot簇生成系統按TruSeq Rapid SR cluster試劑盒說明書進行測序文庫的克隆擴增，然后在Illumina HiSeq 2000測序儀上按照TruSeq Rapid SBS試劑盒說明書進行高通量深度測序。Small RNAs文庫的構建、DNA簇生成及測序均在康成生物公司的協助下完成。

1.4.4 Small RNA 測序數據的處理 Illumina HiSeq 2000測序所得的掃描圖像輸入Off-Line Basecaller軟件進行圖像分析、讀取堿基序列，獲得原始數據；并進行去接頭、去污染、去低質量、去冗余等處理，獲得高質量的干凈序列(序列長度為16～30 nt)并進行序列長度分布分析。隨后利用Novoalign program軟件將干凈序列與miRBase數據庫中已知的人類pre-miRNA進行序列比對(堿基錯配小于或等于1)，獲取兩組樣本已知的miRNA表達豐度等信息。

1.4.5 樣品間miRNA差異表達 為了使各樣本所有的miRNA表達水平都處于同一個量級，首先對miRNA的表達豐度進行標準化處理[公式：標準化表達豐度(TPM) = miRNA表達豐度/樣品中全部miRNA的總表達豐度×106]。差異表達比較時，為了過濾掉兩組樣本中表達水平均比較低的miRNA，并使某一組樣本中標準化表達豐度為0的miRNA也能參與計算，本文參考了Creighton等[7]的方法，在每一個miRNA的標準化表達豐度值中都加入了10TPM來計算差異表達比值。計算公式為：miRNA差異表達比值=(AML組miRNA的標準化表達豐度值+10TPM)/(對照組miRNA的標準化表達豐度值+10TPM)。若miRNA在兩組樣本間差異表達比值大于或等于2.0或小于或等于0.5，則認為該miRNA在兩組樣本間具有明顯的表達差異；比值大于0.5但小于2.0則為表達差異不顯著。若miRNA在兩組樣本中的標準化表達豐度都小于1 TPM，則該 miRNA不參與差異表達分析。

2 結 果

2.1 樣本總RNA的質量檢測結果 組織樣本經TRIzol試劑分離、提取總RNA 后，應用NanoDrop ND-1000分光光度計對樣本總RNA進行質量分析(表1)。結果表明，樣本總RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0，A260/A230比值均大于1.6，提示總RNA純度較高、質量良好。此外，瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)顯示兩組樣品總RNA均可觀察到2條清晰的28 s和18 s電泳條帶，表明提取的樣本總RNA完整性良好，可用于測序文庫的構建。

表1 樣本總RNA質量分析

圖1 樣本總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 測序文庫的質量評估 small RNAs文庫經聚丙烯胺凝膠電泳純化生成后，應用Agilent 2000 Bioanalyzer對文庫進行定量(表2)和質量分析。結果表明，對照組與AML組其small RNAs文庫的摩爾濃度均超過1 fmol/L，其片段長度均在130～155 nt，提示文庫質量完好，可用于測序文庫的簇生成及Illumina測序分析。

表2 測序文庫定量分析

2.3 兩樣本small RNA的序列長度分布 Illumina HiSeq 2000測序所得的small RNA序列經去接頭、去污染、去低質量、去冗余等處理。對照組和AML組分別獲得1 104 855與1 828 670條高質量的干凈序列(序列長度為16～30 nt)，均呈正態分布于22 nt序列兩側(圖2)。其中20～24 nt序列所占比例最高，其在對照組與AML組分別占88.99%和75.03%，提示small RNA序列可以用于后續的miRBase數據庫序列比對和表達分析。

圖2 兩組樣本small RNA文庫的序列長度分布

2.4 miRNA的差異表達分析 將干凈序列與miRBase數據庫中已知的人類pre-miRNA全基因組序列進行序列比對，獲得已知的miRNA表達豐度，再進行標準化和miRNA差異表達比值計算。結果表明，兩樣本共檢出307種具有明顯差異表達的miRNA，其中232種miRNA呈表達上調，75種miRNA呈表達下調，上調和下調差異最顯著的前10種miRNA見表3。上調miRNA的差異表達比值范圍為2～1 144，其中表達比值最高的miRNA為miR-206。而下調miRNA的差異表達比值范圍為0.005～0.500，其中表達比值最低的miRNA為miR-941。

表3 表達上調和下調差異最顯著的前10種miRNA

3 討 論

AML 是老年人中最常見的一種急性血液系統惡性腫瘤，其預后差、病死率高。隨著近年來對AML發病機制研究的不斷深入，發現了一些具有價值的診斷標志物和治療的分子靶點，同時也提出了一些更有針對性的治療方案且取得了一定效果。但對于老年AML患者，包括化療、自體外周血干細胞移植等多種方法都不能提高總體療效，迫切需要尋找新的分子靶點和治療方法。

miRNA是一類內源性小片段單鏈非編碼RNA分子，其基因在基因組上主要定位于基因間隔區及內含子區，具有獨立的啟動子、增強子等表達調控元件，可獨立完成自身基因的轉錄過程。miRNA可通過誘導靶mRNA降解或干擾其翻譯來調節靶基因表達，在個體生長發育、細胞分化、細胞凋亡、機體代謝及腫瘤形成等過程中發揮重要的調控作用[8]。

研究表明，多種miRNA在AML中呈高表達并可作為原癌基因促進腫瘤細胞增殖。miR-125b在AML中呈高表達，它可以通過作用于其靶基因p53及前凋亡蛋白基因Bak1和Bmf等多種方式抑制細胞凋亡，促進腫瘤發生[9]。O′connell等[10]研究發現，在骨髓造血干細胞中過表達miR-125b然后移植小鼠可導致小鼠產生AML，提示miR-125b在AML中起癌基因的功能。有研究表明，miR-155過表達的轉基因小鼠最初在脾臟和骨髓中顯示出白血病前期的前B細胞增殖跡象，然后出現明顯的B細胞增殖，表明miR-155能促進多克隆擴增并具有癌基因功能。隨后的研究發現，miR-155在AML患者骨髓樣本中呈高表達，而在小鼠的骨髓造血干細胞中過表達miR-155可促進粒細胞和單核細胞的增殖并呈現AML的特征[11]。在本研究中，與對照組相比，miR-125b-5p、miR-125b-2-3p和miR-125b-1-3p 3個miR-125b家族的成員及miR-155-5p均呈明顯表達上調，其差異表達比值分別為26.3、6.9、6.5和16.5，提示這些miRNA可能與AML相關，具有潛在的研究價值。

某些miRNA在AML中呈低表達，并可通過激活抑癌基因或誘導粒細胞向成熟細胞分化，進一步發揮其抗腫瘤作用。Garzon等[12]的研究表明，miR-29b可通過作用于其靶基因DNA甲基轉移酶DNMT3A和DNMT3B，下調DNMT3A和DNMT3B表達；亦可通過作用于DNA甲基轉移酶DNMT1的轉錄因子Sp1間接下調DNMT1的表達，從而引起DNA甲基化水平下降并導致抑癌基因p15激活，提示miR-29b具有潛在的抑癌活性。Gong等[13]研究發現，與健康對照組相比，miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b和miR-29c)在AML患者外周血單個核細胞和骨髓細胞中均呈顯著低表達，而在AML細胞中過表達miR-29a、miR-29b和miR-29c均可通過作用于其共同的靶基因AKT2及CCND2抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡。Fazi等觀察到反式維甲酸可通過誘導轉錄因子C/EBPα結合于miR-223的啟動子，上調miRNA-223表達，誘導早幼粒細胞向成熟粒細胞分化，從而發揮其抗白血病作用。而在AML細胞NB4中通過慢病毒載體過表達miR-223亦可取得同樣的效果，表明miR-223在反式維甲酸誘導早幼粒細胞向成熟粒細胞分化過程中具有重要作用。隨后的研究證實，miR-223在AML骨髓樣本中呈低表達，而在AML細胞中過表達miR-223可通過作用于其靶基因核轉錄因子E2F1促進細胞增殖及誘導細胞周期阻滯于G0/G1期[14]。本研究中miR-29b家族的成員miR-29b-3p及miR-233的家族成員miR-223-3p在AML組均呈顯著低表達，其差異表達比值分別為0.125和0.036，提示這些miRNA可能與AML相關，亦具有潛在的研究價值。

本文還發現來自于同一個miR-183基因簇(包括miR-182、miR-96和miR-183)的3個miRNA，其調控方式并不一致，其中miR-183-5p及miR-182-5p呈表達上調，而miR-96-5p呈表達下調。由此提示同一miRNA基因簇中不同的miRNA可能存在各自不同的調控方式。

綜上所述，本研究應用高通量測序技術對AML全基因組miRNA的表達譜進行了研究，初步探討了miRNA表達紊亂與AML之間的關系。發現了多種差異顯著的miRNA可能與AML相關，可作為AML潛在的分子靶點，但其在AML中的作用及其相關分子機制仍有待進一步研究。

[1]Zaidi SK,Trombly DJ,Dowdy CR,et al.Epigenetic mechanisms in leukemia[J].Adv Biol Regul,2012,52(3):369-376.

[2]Estey EH.Treatment of acute myeloid leukemia[J].Haematologica,2009,94(1):10-16.

[3]Subramanian S,Kartha RV.MicroRNA-mediated gene regulations in human sarcomas[J].Cell Mol Life Sci,2012,69(21):3571-3585.

[4]Thomson DW,Bracken CP,Goodall GJ.Experimental strategies for microRNA target identification[J].Nucleic Acids Res,2011,39(16):6845-6853.

[5]Pigazzi M,Manara E,Baron E,et al.miR-34b targets cyclic AMP-responsive element binding protein in acute myeloid leukemia[J].Cancer Res,2009,69(6):2471-2478.

[6]Bousquet M,Harris MH,Zhou B,et al.MicroRNA miR-125b causes leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(50):21558-21563.

[7]Creighton CJ,Reid JG,Gunaratne PH.Expression profiling of microRNAs by deep sequencing[J].Brief Bioinform,2009,10(5):490-497.

[8]何冬梅，吳紅，高楊軍，等．MicroRNA在白血病中的研究新進展[J]．暨南大學學報:自然科學與醫學版，2011，32(4)：362-368．

[9]Gefen N,Binder V,Zaliova M,et al.Hsa-mir-125b-2 is highly expressed in childhood ETV6/RUNX1(TEL/AML1) leukemias and confers survival advantage to growth inhibitory signals Independent of p53[J].Leukemia,2010,24(1):89-96.

[10]O′connell RM,Chaudhuri AA,Rao DS,et al.MicroRNAs enriched in hematopoietic stem cells differentially regulate long-term hematopoietic output[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(32):14235-14240.

[11]O′connell RM,Rao DS,Chaudhuri AA,et al.Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloproliferative disorder[J].J Exp Med,2008,205(3):585-594.

[12]Garzon R,Liu S,Fabbri M,et al.MicroRNA-29b induces global DNA hypomethylation and tumor suppressor gene reexpression in acute myeloid leukemia by targeting directly DNMT3A and 3B and indirectly DNMT1[J].Blood,2009,113(25):6411-6418.

[13]Gong JN,Yu J,Lin HS,et al.The role,mechanism and potentially therapeutic application of microRNA-29 family in acute myeloid leukemia[J].Cell Death Differ,2014,21(1):100-112.

[14]Pulikkan JA,Dengler V,Peramangalam PS,et al.Cell-cycle regulator E2F1 and microRNA-223 comprise an autoregulatory negative feedback loop in acute myeloid leukemia[J].Blood,2010,115(9):1768-1778.

Whole-genome microRNA expression research in acute myeloid leukemia*

XUYong1,LINXiao-cong2,WENJin-li3,LINing4,ZHANGYu-ming4,CHENGWen-biao3,YUXiang-qi3,DAIYong3△

(1.ShenzhenPingshanPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518118,China;2.InstituteofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524023,China;3.ClinicalMedicalResearchCenter,ShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518020,China;4.DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524001,China)

Objective To investigate the differentially expressed microRNA (miRNA) of bone marrow samples between the patients with acute myeloid leukemia (AML) and their controls.Methods Total RNAs were extracted from the bone marrow samples of 15 acute myeloid leukemia patients (AML group) and 10 unexplained anemia or fever patients with normal bone marrow morphology(control group),then were applied to perform global miRNA expression analyses by Illumina deep sequencing technology.Results In total,307 differentially expressed miRNAs including 232 up-regulated and 75 down-regulated miRNAs were indentified in AML group compared with control group according to the high-throughput sequencing data.Conclusion The altered expression profile of miRNA in bone marrow samples of AML patients implies that differentially expressed miRNAs maybe plays roles in the pathogenesis of AML.

acute myeloid leukemia; microRNA; Illumina sequencing; expression profile

深圳市知識創新計劃基礎研究項目(JCYJ20130401093116731)。

徐勇，男，博士，主任技師、研究員、教授，主要從事基礎醫學與檢驗醫學研究。

△通訊作者,E-mail:daiyong2222@gmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.007

A

1672-9455(2015)03-0304-04

2014-07-06

2014-10-19)