Folin-Ciocalteu比色法測定板栗總苞提取液中總多酚的含量

田桂芝，李紹明，王大超，侯立白 (沈陽工學院，遼寧撫順113122)

板栗(Castanea mollissima Blume)屬殼斗科(Fagceae)栗屬喬木類經濟植物，是世界著名的干果之一［1］。主要分布于北半球溫帶及亞熱帶，在我國大部分地區均有分布，以華北和長江流域各地栽培集中。我國板栗年總產量達82．5萬t，占世界總產量的75%［2］。據《中藥大辭典》［3］記載，板栗具有健脾益氣、補腎強筋、散結解毒等功效，能治療丹毒、腫瘤等疾病，就連板栗殼也具有止咳、化痰、清熱、去火的作用，常用于藥物治療。板栗之所以具有上述功能，主要是由于板栗中存在多酚物質。近年來大量研究表明，多酚類化合物具有抗腫瘤［4］、抗病毒、抑菌、抗氧化［5－6］、防衰老等作用［7－8］而被廣泛應用。植物多酚在自然界的儲量非常豐富，其作為一類具有生物活性的天然化合物，對人的身體健康有著重要的影響。而隨著研究的深入，植物多酚在醫學、食品、制革工業、日用化工等方面的應用越來越廣泛，用量越來越大，僅靠原有的多酚資源已明顯不足。而板栗恰恰是含有多酚類的植物之一，因此，有必要對板栗資源進行開發和再利用。特別是板栗總苞作為一種廢棄物，對它的開發和利用將具有重要的經濟價值和社會效應。

目前，對板栗總苞多酚的分析、測定還未見完整的資料報道。盡管資料顯示，常規測定植物多酚含量的方法很多，但多數都是用顯色法，如高錳酸鉀法［9］、酒石酸亞鐵法［10］、普魯士蘭法［11］等，但是高錳酸鉀法具有誤差大、操作繁瑣等缺點，酒石酸亞鐵法對測定兒茶素類物質具有專屬性，普魯士蘭法在測定多酚時具有數據不穩定、誤差大等缺點［12］，而Folin-Ciocalteu比色法是植物多酚類化合物常用的測定方法。但由于植物多酚因來源不同，必定會導致分析條件不同［13－15］。因此，對于越來越多的板栗總苞廢棄物，有必要探索一個簡單、科學、準確的分析多酚的方法，使其得到充分的再利用。筆者采用Folin-Ciocalteu比色法測定板栗總苞中多酚含量，并對碳酸鈉、Folin-Ciocalteu試劑用量及顯色溫度、顯色時間進行優化，建立了測定板栗總苞中多酚含量的方法，為板栗總苞綜合開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料與試劑。板栗總苞，丹東某地收集;沒食子酸(99%)，國藥集團化學試劑有限公司;福林－酚(Folin-Ciocalteu)試劑，自制;無水乙醇、碳酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1．1．2 主要儀器設備。數控超聲波清洗機，濟寧欣鑫超聲電子設備有限公司;RE-52型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;HHS-1S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠;721G型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;ESJ-4B型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司;FW-100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;80目標準檢驗篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司;ZDHW型調溫電熱套，北京中興偉業儀器有限公司;ZGX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司。

1．2 分析方法

1．2．1 溶液及試劑的制備。

1．2．1．1 沒食子酸標準溶液的制備。準確稱取0．100 0 g沒食子酸，用蒸餾水溶解并定容至100 ml容量瓶中，即得到質量濃度為1．000 mg/ml的沒食子酸標準溶液。

1．2．2 分析條件的確定。福林酚法的分析原理:在堿性溶液中鎢鉬酸鹽可以將多酚等還原性物質定量氧化，而本身被還原(使W6+變為W5+)生成藍色的化合物，藍色的深淺程度與多酚含量成正比。

1．2．2．1 最佳波長的確定。各取0．50 ml沒食子酸標準溶液和板栗總苞提取液，分別置于25 ml比色管中，依次加入5．0 ml水、2．0 ml福林酚試劑，1 min 后加入 5．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后于室溫反應1．5 h，然后用可見分光光度計在400～900 nm范圍內掃描，從而確定最佳波長。

1．2．2．2 福林－酚加入量的確定。取8只25 ml比色管分別加入0．50 ml板栗總苞提取液、5 ml水、不同體積(0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0 ml)的福林 － 酚試劑，1 min后加入8 ml 15%的Na2CO3溶液，然后定容。室溫下反應1.5 h后，在確定的最佳波長下測量各樣品的吸光度(A)，以確定福林－酚試劑的最佳加入量。

1．2．2．3 碳酸鈉溶液加入量的確定。取10只25 ml比色管，各加入 0．50 ml板栗總苞提取液、5．0 ml水、3．0 ml福林－酚試劑，1 min 后分別加入 1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0 ml 15%的 Na2CO3溶液，定容后于室溫下反應1．5 h，在確定的最佳波長下測定吸光度，以確定碳酸鈉的最佳加入量。

1．2．2．4 反應時間的確定。取板栗總苞提取液0．50 ml于25 ml比色管中，加入5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后每隔10 min在確定的最佳波長下測定吸光度1次，以確定最佳反應時間。

1．2．2．5 反應溫度的確定。取7份0．50 ml板栗提取液于25 ml比色管中，分別加入5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后，分別在25、30、35、40、45、50、55 ℃反應 70 min 后，在確定的最佳波長下測定吸光度，以確定最佳反應溫度。

考古學發現的諸多史前遺存，由于分布地域不同，時代不同，為了準確的描述和研究它們，需要給遺址進行準確嚴格的命名，這樣就確立了考古學文化。

1．2．3 板栗總苞中多酚含量的測定。

1．2．3．1 標準曲線的制作。分別取濃度為50μg/ml的沒食子酸標準溶液 0、0．50、1．00、1．50、2．50、3．50、4．50 ml于 7 支25 ml比色管中，加入5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，定容后在40℃條件下，反應70 min。冷卻至室溫后在確定的最佳波長下測定吸光度。以標準溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1．2．3．2 板栗總苞提取液中多酚含量的測定。取板栗總苞多酚提取液 0．40 ml，加 5．0 ml水、3．0 ml福林 － 酚試劑，1 min后加入6．0 ml 15%的Na2CO3溶液，混勻后定容。40℃條件下反應70 min，在確定的最佳波長下測定吸光度。根據標準曲線所得到的線性方程，計算出板栗總苞中多酚的含量。

1．3 分析方法評價

1．3．1 精密度試驗。取0．40 ml板栗總苞提取液于25 ml比色管中，按“1．2．2”所確定的最佳條件連續測定5次吸光度，計算相對標準偏差，評價儀器的精密度。

1．3．2 重復性試驗。取5份0．40 ml板栗總苞提取液于5支25 ml比色管中，按“1．2．2”所確定的最佳條件依次測定吸光度，計算相對標準偏差，評價分析方法的精密度。

1．3．3 穩定性試驗。取0．40 ml板栗總苞提取液于25 ml比色管中，按“1．2．2”所確定的最佳條件反應70 min 后，在3．5 h內每隔30 min測定一次吸光度，計算其相對標準偏差，評價分析方法的穩定性。

1．3．4 加標回收試驗。取6份0．40 ml板栗總苞提取液于6支 25 ml比色管中，分別加入 0、0．50、1．00、1．50、2．00、2.00 ml沒食子酸標準溶液，按“1．2．2”所確定的最佳條件依次測定吸光度，計算沒食子酸的回收率和相對標準偏差，評價分析方法的可靠性。

2 結果與分析

2．1 分析條件的確定

2．1．1 最佳波長的選擇。由圖1可見，沒食子酸和板栗總苞提取液經顯色反應后的光譜吸收曲線具有相似的形狀，均在760 nm處有最大吸收峰。所以測定板栗總苞多酚含量可以用沒食子酸作為標準物質，同時760 nm為最佳波長。

2．1．2 福林－酚加入量的確定。由圖2可見，隨著福林－酚加入量的增加，吸光度逐漸增大，說明顯色劑與多酚反應的程度逐漸增強。當其加入量達到3．0 ml時，其吸光值趨于極大，之后變化不明顯，說明此時試液中的多酚已基本反應完全。所以選擇福林－酚的最佳用量為3．0 ml。

2．1．3 碳酸鈉溶液加入量的確定。由圖3可見，隨著碳酸鈉溶液加入量的增加，吸光度增大，說明堿性的適宜條件逐漸接近。當碳酸鈉溶液加入量為6．0 ml時，其吸光度度達到最大，之后有所下降。所以15%碳酸鈉的最佳用量為6．0 ml。

2．1．4 反應時間的確定。由圖4可見，隨著反應時間的增加，其吸光度增大;在1 h之內隨時間增加，其吸光度明顯增加，1 h之后增加比較緩慢。當反應時間達到70 min以后，吸光度略有增加，但變化不大。從分析速度、分析成本及對分析結果的影響考慮，選擇70 min為最佳反應時間。

2．1．5 反應溫度的確定。由圖5可見，隨著溫度的升高，吸光度增大，當溫度達到40℃時，其吸光度達到最大。隨后吸光度隨溫度升高而下降。當溫度超過45℃時，吸光度明顯下降，說明升高溫度有利于顯色反應的發生，但溫度過高，顯色產物的穩定性下降。所以選擇40℃為最佳反應溫度。

2．2 板栗總苞多酚含量的測定 測定板栗總苞提取液中多酚含量所用的標準曲線見圖6。其線性方程為y=0．135 1x+0．019 0，R2=0．999 3，沒食子酸標準溶液的吸光度與質量濃度在0～9μg/ml范圍內線性關系良好。該方程可用于板栗總苞提取液中多酚含量的定量計算。

以沒食子酸為對照物，按“1．2．3．2”方法測定板栗總苞中的多酚含量為84．81 mg/g，RSD 為2．1%。

2．3 分析方法的評價

2．3．1 儀器精密度試驗。試驗得出，對樣品進行5次測定的吸光度(A)依次為 0．480、0．480、0．479、0．480、0．479。數據表明，5次測定結果的相對標準偏差(RSD)為0．11%，說明儀器的精密度良好。

2．3．2 重復性試驗。試驗得出，對樣品進行5次測定的吸光度(A)依次為 0．480、0．482、0．483、0．480、0．484。數據表明，5次測定結果的相對標準偏差(RSD)為0．37%，說明分析方法的精密度較高。

2．3．3 穩定性試驗。試驗得出，測定時間為 0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5 h 時，吸光值(A)依次為 0．479、0．479、0．479、0．480、0．480、0．481、0．482、0．482。數據表明，在3．5 h內隨著時間的增加，吸光度沒有明顯變化，測定的相對標準偏差(RSD)為0．13%，說明該分析試液具有良好的穩定性。

2．3．4 加標回收試驗。表1數據表明:用該分析方法對板栗總苞中多酚含量測定時，沒食子酸的加標回收率在98．0%～101．0%，平均回收率為99．5%，相對標準偏差為1.2%。結果表明，該分析方法的準確度較高，可用于板栗總苞多酚含量的測定。

表1 加標回收試驗結果

3 結論

用福林－酚法測定板栗總苞多酚含量時，可以用沒食子酸為標準物質。其最佳測定條件是:取0．50 ml板栗總苞提取液，加入3．0 ml福林 － 酚試劑、6．0 ml 15%的 Na2CO3溶液，在40℃條件下反應70 min。測定最佳波長為760 nm。吸光度與多酚含量在0～9μg/ml范圍內有良好的線性關系，該方法的平均加標回收率為99．5%，相對標準偏差為1.2%(n=5)。該方法具有精密度高、穩定性好、操作簡單、快速、結果準確等優點，可用于板栗總苞多酚含量的測定。

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