NLRP3炎癥小體在心肌梗死中作用的研究進展

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NLRP3炎癥小體在心肌梗死中作用的研究進展

陳海燕，譚春燕，胡厚祥

(川北醫學院附屬醫院心內科，四川南充637000)

【摘要】NLRP3炎癥小體是固有免疫系統中模式識別受體家族的重要組成部分。NLRP3炎癥小體一旦被激活，將募集適配器凋亡相關微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)，并與之相互作用，從而招募并結合半胱天冬氨酸蛋白酶-1前體(procaspase-1)，使其自身裂解活化為半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，最終使IL-1β前體(pro-IL-1β)和IL-18前體(pro-IL-18)成熟活化為有活性的促炎性細胞因子(IL-1β和IL-18)，并啟動焦亡性細胞死亡(pyroptosis)。NLRP3炎癥小體與多種疾病的發病機理有著密切的關系。近年來研究報道，NLRP3炎癥小體識別非微生物危險信號引起的無菌性炎性反應在心肌梗死的發展過程中發揮著重要作用。本文就NLRP3在心肌梗死中的相關研究作一綜述。

【關鍵詞】NLRP3;炎癥小體;心肌梗死

急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)嚴重威脅著廣大患者的健康，被預測為全球人類未來死亡的主要原因。心肌梗死是因心肌嚴重而持久的缺血造成的心肌細胞死亡。心肌梗死后將引起左心室泵血功能進一步退化，最終導致心力衰竭。另外，心肌梗死后心肌細胞的異常放電將引起不穩定性和致命性心律失常。心肌梗死的根本原因在于冠狀動脈粥樣硬化，因冠狀動脈內粥樣斑塊不穩定或破裂而導致血管內血栓形成，阻塞冠狀動脈，最終導致心肌梗死。有效的再灌注和血管重建［如，溶栓治療和經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)］可有效的減少心肌梗死面積和改善臨床癥狀。然而，再灌注本身也可引起和加重心肌損傷，稱為再灌注損傷(reperfusion injury)［1］。

近來研究表明，伴隨心肌梗死的炎癥反應使白細胞聚集，導致心肌損傷和瘢痕形成。同時，心肌梗死處積聚的白細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞)釋放細胞因子、趨化因子和蛋白酶，加劇心肌梗死后的炎癥反應，促進心肌的損傷和重構［2-3］。Kawaguchi等［4］使用ASC敲除鼠(ASC-/-mice)進行研究，發現在心肌缺血再灌注損傷中，無菌性炎癥反應是通過炎癥小體的活化產生的。這些研究說明炎癥小體是心肌梗死病理生理過程中無菌性炎癥反應的初始傳感器。本文就當前的研究情況重點對NLRP3炎癥小體在心肌梗死過程中的作用作一綜述。

1　固有免疫系統和模式識別受體

固有免疫作為機體抵御外來病原體入侵的第一道防線，由種系編碼的模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)多家族成員組成。固有免疫通過模式識別受體識別病原體的保守結構和內源性危險信號，即病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)來觸發炎癥反應。其中，DAMPs引發的炎癥反應作為無菌性炎癥反應的潛在機制已受到大家的廣泛關注［5］。目前為止，模式識別受體分為4個不同的家族: Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、RIG-I樣受體(retinoic acid-inducible gene-I-like receptors，RLRs)、c-型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)和NOD樣受體(Nod-like receptors，NLRs)。其中，TLRs和NLRs已被證實與心肌梗死中無菌性炎癥反應有關［6-7］。NLRs是調節有活性的炎性細胞因子IL-1β釋放的炎癥小體的主要組成部分;而TLRs則通過誘導pro-IL-1β的合成來促進IL-1β的產生。二者共同參與心肌梗死過程中的炎性損傷。然而，關于RLRs和CLRs在心肌梗死過程中發揮的作用還有待進一步研究。

2　NLRP3　炎癥小體及其活化

炎癥小體是一種多蛋白復合形成的胞內模式識別受體，通過識別病原體相關分子模式(PAMPs)或損傷相關分子模式(DAMPs)活化，并可作為激活caspase-1的分子平臺。大多數的炎癥小體都包含有NLR家族蛋白、凋亡相關微粒蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)。目前為止，NLRs家族蛋白在人類已發現有23種分子［8］，每種炎癥小體根據其包含的NLR家族蛋白不同而命名。NLRs參與組成的炎癥小體包括: NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12和NLRC4。而AIM2炎癥小體和IFI16炎癥小體由PYHIN參與組成。

在這些炎癥小體中，NLRP3是研究最為廣泛的炎癥小體，大量研究表明:在很多疾病中，NLRP3通過識別危險信號誘導無菌性炎癥而產生。NLRP3炎癥小體主要包括3個組成結構:①位于中央區的核苷酸結合寡聚化域(NACHT域)，它在低聚體結構形成的過程中發揮著重要作用;②C端亮氨酸富集結構域(LRRs)，LRR識別相應配體，并在NLRP3功能調節中發揮重要作用;③N端效應結構域(包括PYD、CARD和BIR)，能夠介導下游信號傳導［9］。NLRP3的LRRs識別相應配體后啟動NLRP3炎癥小體復合體的組裝。目前科研工作者普遍認為，NLRP3炎癥小體活化的共同上游機制包括:細胞內K+外流、溶酶體破裂以及活性氧(ROS)的產生［10］。NLRP3炎癥小體一旦被激活，其PYD結構域募集適配器ASC和pro-caspase-1，使pro-caspase-1自身裂解為有活性的caspase-1。活化的caspase-1進一步將促炎性細胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18裂解為其成熟的分泌形式。同時，活化的caspase-1觸發一種特殊的細胞程序性死亡，即細胞焦亡(pyroptosis)［11］。細胞焦亡是近年來發現的一種新的細胞程序性死亡方式，它兼有細胞凋亡和細胞壞死的特征。與凋亡相似的是:細胞焦亡有核濃縮、DNA斷裂及TUNEL染色陽性;與壞死共同的特征為:焦亡細胞的細胞膜完整性遭到破壞，細胞內離子平衡喪失，出現細胞腫脹繼而膜破裂，細胞內容物釋放后引起大量炎癥反應［12］。激活NLRP3的內源性的危險信號包括:細胞外ATP、尿酸鹽結晶、磷酸鈣晶體、膽固醇結晶、淀粉樣蛋白質-β、透明質酸和胰島淀粉樣多肽;而NLRP3炎癥小體外源性的激活劑包括石棉和二氧化硅［10］。在各種疾病的發展過程中，上述這些危險因素通過活化NLRP3，誘導IL-1β釋放，從而產生炎癥反應。然而，誘導IL-1β釋放的過程還需要pro-IL-1β的轉錄誘導［13］。因此，對pro-IL-1β的轉錄誘導過程和炎癥小體介導的IL-1β釋放過程進行調節被認為是炎癥細胞因子調控中必不可少的環節。

3　NLRP3　炎癥小體與心肌梗死

炎癥反應是參與介導心肌梗死后心肌損傷和修復的一個重要過程。有研究表明，對心肌梗死過程中炎癥反應進行干預可有效改善心肌梗死癥狀，減少MI面積［14］。在這些炎性介質中，IL-1β是心肌梗死過程中早期突出的炎性介質。Abbat等［15］在急性心肌梗死的動物模型上實驗，顯示IL-1β中和抗體及IL-1β重組受體拮抗劑(IL-1RA)可減輕小鼠急性心肌梗死后心臟的擴大及心肌功能的紊亂，表明IL-1β參與急性心肌梗死發生發展中細胞的損傷過程。此外，Marchetti等［16］建立大鼠心肌缺血再灌注模型(缺血30 min，再灌注24 h)，發現抑制NLRP3炎癥小體的活性可減少心肌梗死面積及大鼠血清中心肌肌鈣蛋白I的水平。

為了進一步研究炎癥小體在心肌I/R損傷的病理生理過程中發揮的作用，Kawaguchi等［4］使用ASC敲除鼠(ASC-/-mice)和caspase-1敲除鼠(caspase-1-/-mice)建立心肌缺血再灌注模型(結扎左前降支冠狀動脈30 min，再灌注48 h)進行研究，在入侵的中性粒細胞和巨噬細胞以及在心肌I/R處的心肌成纖維細胞中都能檢測到大量的ASC表達。而且，與野生鼠(WT mice)相比，ASC-/-鼠和caspase-1-/-鼠I/R后炎癥反應大幅下降，表現為炎性細胞浸潤減少，細胞因子和趨化因子表達降低。此外，敲除鼠的心肌梗死面積、心肌纖維化以及梗死后左心室功能紊亂程度均明顯減低。

NLRP3炎癥小體識別不同的危險信號，誘導無菌性炎癥反應，使之成為AMI過程中發揮作用的模式識別受體的最佳候選成員。Mezzaroma等［17］在使用永久性心肌梗死模型的老鼠身上進行研究，發現使用小干擾RNA(siRNA)或藥物抑制NLRP3和P2X7受體將使炎癥小體活化受到抑制，從而減少心肌細胞的死亡，最終減輕心肌梗死后心肌的重構。P2X7是一種嘌呤受體通道，它被受損細胞釋放的細胞外ATP激活，從而引起K+外流，最終活化NLRP3炎癥小體。心肌細胞中，NLRP3炎癥小體的組裝和活化進一步誘導caspase-1依賴的心肌細胞焦亡。Sandanger等［18］在小鼠和大鼠身上建立永久性心肌梗死模型，檢測到心肌缺血處成纖維細胞的NLRP3表達明顯上調，這說明NLRP3參與心肌梗死的發展過程。進一步研究發現，心肌梗死期間受損組織釋放的細胞外ATP刺激心肌成纖維細胞，使之分泌IL-1β引起炎癥反應。此外，使用Langendorff離體心臟灌注模型模擬人體的心肌缺血再灌注，發現NLRP3敲除后可保護心肌缺血再灌注損傷后心臟的功能以及減少心肌梗死的面積。近來，Liu等［19］在C57BL/6J小鼠身上建立心肌缺血再灌注模型(缺血30 min，再灌注3～24 h)，檢測到缺血的心臟中NLRP3表達上調，caspase-1活性增加，IL-1β和IL-18產生增加;心肌內注射NLRP3小干擾RNA (siRNA)或腹腔注射炎癥小體抑制劑BAY 11-7028后可減少心肌缺血再灌注損傷區域的巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤。同時，心肌細胞的凋亡和心肌梗死面積也隨之減少。

然而，在研究NLRP3在心肌梗死和心肌缺血再灌注損傷過程中所起作用的同時，我們也發現了一些有趣的問題。Sandanger等［18］從小鼠身上分離出心臟，并使用Langendorff離體心臟灌注模型模擬人體的心肌缺血再灌注，發現與野生鼠和ASC敲除鼠相比，NLRP3敲除鼠在進行心肌缺血再灌注后，其心臟功能明顯得到改善，心肌損傷也顯著減輕，這表明在心肌缺血再灌注損傷中NLRP3和ASC起著不同的作用。同樣地，Shigeoka等［20］在小鼠身上建立腎缺血再灌注模型實驗，發現與野生鼠相比，NLRP3敲除鼠中腎I/R損傷減輕，而ASC敲除鼠中I/R損傷無明顯改變。近來，在肝臟缺血再灌注研究中發現，NLRP3敲除后肝臟缺血再灌注損傷明顯減輕，而ASC敲除后肝臟I/R損傷并無明顯改善［21］。這些研究表明，炎癥小體的組件(如NLRP3和ASC)可能有獨立于炎癥小體的功能，而NLRP3和ASC在不同的細胞可能有著不同的功能。此外，NLRP3參與一種炎癥小體(NLRP3炎癥小體)的組成，而ASC可參與多種炎癥小體(如NLRP3、NLRP1、NLRP6 和AIM2炎癥小體)的組成，表明其他炎癥小體可能存在潛在的功能補充作用。

4　抗炎癥小體治療策略

越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體啟動的炎性反應參與心肌梗死的病理生理過程。因此，針對NLRP3和IL-1β的治療可能成為治療MI潛在而有效的治療策略。調節炎癥小體，可從其上游通路及下游效應因子進行調控。上游通路包括:調控NF-κB以調節pro-IL-1β和pro-IL-18的表達、拮抗激動受體(如P2X7r)、干擾其復合體組件(NLRPs、ASC、和caspase-1)及細胞內激動劑(如ROS);下游效應因子包括成熟的IL-1β和IL-18［22］。

大量動物實驗表明，針對炎癥小體組件及活化劑的抗體和抑制劑能夠取得良好效果，但其在人體發揮的效應還尚不明確。炎癥小體抑制劑Bay 11-7082通過抑制NLRP3的ATP酶的活化起作用; P2X7r抑制劑AZD9056，正在人類風濕性關節炎(RA)上進行測試，但至今尚無良好的效果［23］。針對ROS(3種激活NLRP3炎癥小體途徑之一)的治療似乎是一種很好的選擇，但是研究結果顯示其在人體的效果并不令人滿意。依達拉奉是一種自由基清除劑，早在2001年就有人發現它可改善患者腦缺血性發作后的臨床癥狀［22］，但是進一步研究發現其產生的效果并不局限于阻滯炎癥小體的活化。Caspase-1抑制劑已在很多動物身上進行實驗，VRT-018858是一種選擇性的非縮氨酸類的caspase-1抑制劑，它可減輕大鼠短暫性腦缺血后的腦損傷。Ac-YVAD.CMK是另一種caspase-1抑制劑，Fann等［24］在C57BL/6J小鼠身上建立腦缺血再灌注模型(閉塞的大腦中動脈1 h，再灌注3 h)進行實驗，發現Ac-YVAD.CMK可減少小鼠腦缺血再灌注后的腦梗死面積，并減少IL-1β和IL-18的產生。但是，caspase-1抑制劑對人體心血管疾病的作用還有待進一步研究。

在針對炎癥小體的治療策略中，研究更為廣泛的是對IL-1途徑進行調制［25］。阿那白滯素(Anakinra)是一種非糖基化的人類IL-1受體拮抗劑重組體，它通過競爭性的結合IL-1I型受體來阻滯IL-1(包括IL-1α和IL-1β)的生物學活性;利納西普(Rilonacept)是一種二聚融合蛋白，位于人類IL-1R 和IL-1R輔助蛋白的配體結合域，能夠阻滯IL-1α 和IL-1β;康納單抗(Canakinumab)是一種能夠中和IL-1β的單克隆抗體，它通過選擇性的與IL-1β結合，使其失活。此外，有研究表明在大鼠心肌梗死模型中，抗IL-18中和抗體能夠明顯減少大鼠MI的梗死面積。在其他一些缺血再灌注損傷模型中，抗IL-18也能取得明顯的效果。

綜上所述，大量研究表明，NLRP3在心肌梗死過程中通過形成炎癥小體后活化caspase-1，介導IL-1β 和IL-18的產生，在AMI過程中起著關鍵作用。針對NLRP3炎癥小體及其上游通路和下游效應因子的藥物在動物身上也取得了良好的效果。然而，由于基因組的反應性不同，將動物模型上做的研究轉移到人類疾病還存在很大的障礙。另外，炎癥反應在心肌梗死中的作用有利也有弊，完全干預炎癥小體相關的固有免疫還可能導致機會性感染。因此，對于NLRP3炎癥小體激活的確切機制以及針對NLRP3在人類身上的有效治療策略還需進一步的研究。

參考文獻

［1］Chang R，Li Y，Yang X，et al.Protective role of deoxyschizandrin and schisantherin A against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］.PloS one，2013，8(4): e61590.

［2］Seropian IM，Toldo S，Van Tassell BW，et al.Anti-inflammatory strategies for ventricular remodeling following ST-segment elevation acute myocardial infarction［J］.Journal of the American College of Cardiology，2014，63(16):1593-1603.

［3］Seropian IM，Sonnino C，Van Tassell BW，et al.Inflammatory markers in ST-elevation acute myocardial infarction［J］.European heart journal Acute cardiovascular care，2015，pii: 2048872615568965.［Epub ahead of print］

［4］Kawaguchi M，Takahashi M，Hata T，et al.Inflammasome activation of cardiac fibroblasts is essential for myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Circulation，2011，123(6):594-604.

［5］Gombault A，Baron L，Couillin I.ATP release and purinergic signaling in NLRP3 inflammasome activation［J］.Frontiers in immunology，2012，3:414.

［6］Feng Y，Chao W.Toll-like receptors and myocardial inflammation ［J］.International journal of inflammation，2011，doi: 10.4061/2011/170352.

［7］Takahashi M.Role of the inflammasome in myocardial infarction ［J］.Trends in cardiovascular medicine，2011，21(2):37-41.

［8］Ozaki E，Campbell M，Doyle SL.Targeting the NLRP3 inflammasome in chronic inflammatory diseases: current perspectives［J］.Journal of inflammation research，2015，16(8):15-27.

［9］Sutterwala FS，Haasken S，Cassel SL.Mechanism of NLRP3 inflammasome activation［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2014，1319:82-95.

［10］Gao J，Liu RT，Cao S，et al.NLRP3 Inflammasome: Activation and Regulation in Age-Related Macular Degeneration［J］.Mediators of inflammation，2015，2015:690243.

［11］Latz E，Xiao TS，Stutz A.Activation and regulation of the inflammasomes［J］.Nature reviews Immunology，2013，13(6):397-411.

［12］Galluzzi L，Vitale I，Abrams JM，et al.Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012［J］.Cell death and differentiation，2012，19(1):107-120.

［13］Gurung P，Lukens JR，Kanneganti TD.Mitochondria: diversity in the regulation of the NLRP3 inflammasome［J］.Trends in molecular medicine，2014.doi:10.1016/j.molmed.2014.11.008.

［14］Lugrin J，Parapanov R，Rosenblatt-Velin N，et al.Cutting edge: IL-1alpha is a crucial danger signal triggering acute myocardial inflammation during myocardial infarction［J］.Journal of immunology，2015，194(2):499-503.

［15］Abbate A，Van Tassell BW，Seropian IM，et al.Interleukin-1beta modulation using a genetically engineered antibody prevents adverse cardiac remodelling following acute myocardial infarction in the mouse［J］.European journal of heart failure，2010，12(4):319-322.

［16］Marchetti C，Chojnacki J，Toldo S，et al.A novel pharmacologic inhibitor of the NLRP3 inflammasome limits myocardial injury after ischemia-reperfusion in the mouse［J］.Journal of cardiovascular pharmacology，2014，63(4):316-322.

［17］Mezzaroma E，Toldo S，Farkas D，et al.The inflammasome promotes adverse cardiac remodeling following acute myocardial infarction in the mouse［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(49):19725-19730.

［18］Sandanger O，Ranheim T，Vinge LE，et al.The NLRP3 inflammasome is up-regulated in cardiac fibroblasts and mediates myocardial ischaemia-reperfusion injury［J］.Cardiovascular research，2013，99 (1):164-174.

［19］Liu Y，Lian K，Zhang L，et al.TXNIP mediates NLRP3 inflammasome activation in cardiac microvascular endothelial cells as a novel mechanism in myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Basic research in cardiology，2014，109(5):415.

［20］Shigeoka AA，Mueller JL，Kambo A，et al.An inflammasome-independent role for epithelial-expressed Nlrp3 in renal ischemia-reperfusion injury［J］.Journal of immunology，2010，185(10): 6277- 6285.

［21］Inoue Y，Yasuda Y，Takahashi M.Role of the inflammasome in inflammatory responses and subsequent injury after hepatic ischemiareperfusion injury［J］.Hepatology，2013，58(6):2212.

［22］Li X，Deroide N，Mallat Z.The role of the inflammasome in cardiovascular diseases［J］.Journal of molecular medicine，2014，92 (4):307-319.

［23］Keystone EC，Wang MM，Layton M，et al.Clinical evaluation of the efficacy of the P2X7 purinergic receptor antagonist AZD9056 on the signs and symptoms of rheumatoid arthritis in patients with active disease despite treatment with methotrexate or sulphasalazine ［J］.Annals of the rheumatic diseases，2012，71 (10): 1630-1635.

［24］Fann DY，Lee SY，Manzanero S，et al.Intravenous immunoglobulin suppresses NLRP1 and NLRP3 inflammasome-mediated neuronal death in ischemic stroke［J］.Cell death＆disease，2013，4: e790.

［25］Mitroulis I，Skendros P and Ritis K.Targeting IL-1beta in disease; the expanding role of NLRP3 inflammasome［J］.European journal of internal medicine，2010，21(3):157-163.

通訊作者:胡厚祥，E-mail: hhxiang17@163.com

作者簡介:陳海燕(1988-)，女，四川南充人，碩士研究生，主要從事心血管疾病方面的研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(81070101)

收稿日期:2014-12-25

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.02.06

【文章編號】1005-3697(2015)02-0155-05

【中圖分類號】R541.4

【文獻標志碼】A

網絡出版時間: 2015-5-1 01∶33網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.003.html