姜黃素與靈芝孢子對非酒精性脂肪肝SREBP-1cmRNA的影響①

韓東東，張東東，趙蕓鶴，梁衍鋒，賈 楠，畢 博，張洋洋，黃 如，徐永記，郭 蒙，曹啟博，宮天宇，張 雷

(1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學基礎醫學院, 黑龍江 佳木斯 154007)

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姜黃素與靈芝孢子對非酒精性脂肪肝SREBP-1cmRNA的影響①

韓東東1，張東東2，趙蕓鶴1，梁衍鋒2，賈 楠1，畢 博1，張洋洋1，黃 如2，徐永記2，郭 蒙1，曹啟博2，宮天宇2，張 雷1

(1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學基礎醫學院, 黑龍江 佳木斯 154007)

目的：分別研究姜黃素與靈芝孢子對非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)小鼠肝臟固醇調節元件結合蛋白 1c(sterol-regulatoryelementbindingprotein-1c,SREBP-1c)表達的影響，從分子水平對比不同中藥對于NAFLD的治療作用。方法：采用RT-PCR方法對比不同分組(正常組、NAFLD模型組、姜黃素干預組、靈芝孢子干預組)小鼠肝臟SREBP-1c的mRNA表達。結果：與正常組對比，SREBP-1cmRNA在模型組表達明顯增高，而在姜黃素干預組及靈芝孢子干預組均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。兩種中藥干預組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：NAFLD模型組肝臟中SREBP-1cmRNA的表達明顯增高；姜黃素與靈芝孢子對于NAFLD小鼠肝臟SREBP-1cmRNA表達的影響無明顯差異。

非酒精性脂肪肝；姜黃素；靈芝孢子；固醇調節元件結合蛋白 1c

非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是指無過量飲酒史、病毒感染或其它特定病原體感染史，以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1,2]，發病機制較為復雜。固醇調節元件結合蛋白1c(sterol-regulatoryelementbindingprotein-1c,SREBP-1c)與肝臟脂質代謝密切相關，可在轉錄水平調節脂質合成相關酶等基因的表達，并可與UPR信號通路協同作用，通過內質網應激促進NAFLD的發生發展[3]。各種研究表明，姜黃素和靈芝孢子均具有保肝護肝作用[4～8]。姜黃素為橙黃色結晶粉末，從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取而來。有報道顯示[8]靈芝孢子能明顯降低注射四氯化碳引起肝纖維化模型中血清ALT及肝臟甘油三脂。本研究以姜黃素及靈芝孢子保肝護肝作用為基礎，對比二者干預NAFLD后小鼠肝臟SREBP-1cmRNA的表達，從分子水平探討姜黃素及靈芝孢子對NAFLD的治療機制。

1 材料和方法

1.1 材料

95%姜黃素及靈芝孢子(藥物研究所)；引物、DEPC(上海生物工程技術有限公司)；勻漿振蕩玻珠(北京冬璞泰和科技有限責任公司)；瓊脂糖(美國Sigma公司)；TAKARA反轉錄試劑盒、TAKARARNAisoPlus、DL1000DNAMarker(大連寶生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型及分組

將適應性喂養3d的60只雄性昆明種小鼠隨機分為4組：正常組、NAFLD模型組、姜黃素干預組、靈芝孢子干預組。正常組正常飼養，其余組均飼高脂飲食(自制，包括：基礎飼料80.5%、蛋黃粉10%、豬油7%、膽固醇2%及膽鹽0.5%)。4周后姜黃素干預組和靈芝孢子干預組分別強飼姜黃素及靈芝孢子生理鹽水混濁液，正常組和模型組用同體積生理鹽水替代。3個月后取模型組肝臟進行HE染色，確定造模成功后取材。

1.2.2RT-PCR

(1)實驗準備：用1‰DEPC水將所有接觸RNA的器具浸泡24h，高溫高壓滅菌并蒸發DEPC后烘干備用。

(2)總RNA提取及檢測：按照TAKARARNAisoPlus試劑盒說明操作。①勻漿 肝組織50mg，加入適量振蕩玻珠及RNAisoPlus振蕩勻漿，低溫離心機預設4℃、12,000g，離心5min，取上清液；②氯仿，低溫4℃、12,000g，離心15min，取上層水相；③異丙醇，等體積，低溫4℃、12,000g，離心10min，棄上清，管底為RNA沉淀；④75%DEPC酒精清洗，室溫干燥10min，RNase-free水溶解，檢測RNA質量，調整濃度后反轉錄或-80℃保存。

(3)反轉錄：按照TAKARA反轉錄試劑盒說明書步驟進行反轉錄，所得cDNA可保存在-20℃冰箱。 (4)PCR：SREBP-1cmRNA的擴增片斷長度為257bp，其上游引物為5’-TGGCTTGGTGATGCTATGTT-3’，下游引物為5’-TAAGGGGTTGGGAGTAGAGG-3’。GAPDH內參的擴增片斷長度為452bp，其上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈照相保存。

1.3 統計學方法

2 結果

如圖1、2、3顯示，4個實驗組均可在452bp處見到GAPDH的擴增產物條帶，在257bp處見到SREBP-1c的擴增產物條帶，與目的基因產物長度吻合。計算SREBP-1c與GAPDH的掃描圖像凈光密度數值比值后，經方差分析顯示小鼠肝臟組織的SREBP-1cmRNA在模型組表達增高，在姜黃素干預組和靈芝孢子干預組表達均降低。經統計學分析，正常組、模型組、姜黃素干預組之間相比較差異有極顯著性意義(P<0.01)；組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。正常組、模型組、靈芝孢子干預組之間相比較差異有極顯著性意義(P<0.01)；組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。姜黃素干預組與靈芝孢子干預組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 正常組、NAFLD模型組GAPDH、 SREBP-1cmRNA的RT-PCR反應條帶

圖2 姜黃素干預組GAPDH、SREBP-1cmRNA的RT-PCR反應條帶

圖3 靈芝孢子干預組GAPDH、SREBP-1cmRNA的RT-PCR反應條帶

表1 4組動物肝臟組織SREBP-1c mRNA半定量分析

3 討論

固醇調節元件結合蛋白 (sterol-regulatoryelementbindingproteins,SREBPs) 有3種同型異構體(SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2)，無活性前體與內質網膜及核膜相連， 內質網應激時因固醇耗竭導致SREBPs從膜上脫離，使啟動子激活而上調脂肪酸和膽固醇的生物合成[9]。SREBP-1c在肝臟表達較高，是調控脂肪酸和甘油三酯合成基因的主要轉錄因子，能通過脂肪酸上調CYP2E1和CYP4A的表達而促進肝內氧化應激和脂質過氧化，誘導NAFLD發生[10]。本實驗結果顯示，與正常組相比，NAFLD模型組SREBP-1cmRNA的表達增高，差異有顯著性(P<0.05)。說明NAFLD肝臟中SREBP-1cmRNA的表達明顯增高，與Horton[9]和XuYJ[11]等研究結果一致。與模型組相比，肝臟SREBP-1cmRNA在姜黃素干預組和靈芝孢子干預組中表達均降低，差異有顯著性(P<0.05)。說明姜黃素和靈芝孢子對于NAFLD均有一定的治療效果，二者均可通過降低肝臟中SREBP-1cmRNA的表達，進而可能通過影響肝臟內質網應激和調節脂代謝來影響NAFLD的發生發展。SREBP-1cmRNA在姜黃素干預組與靈芝孢子干預組間表達差異無統計學意義，顯示兩種中藥對于小鼠NAFLD的SREBP-1cmRNA調節無明顯差異，可繼續對比對其他調節因子的影響或進一步開發靈芝孢子的保肝護肝價值。

[1]GiovanniMusso,RobertoGambino,MaurizioCassader.Recentinsightsintohepaticlipidmetabolisminnon-alcoholicfattyliverdisease(NAFLD) [J].ProgressinLipidResearch,2009,48(1):1-26

[2]SPetta,CMuratore,ACrax.Non-alcoholicfattyliverdiseasepathogenesis:Thepresentandthefuture[J].DigestiveandLiverDisease,2009，1-11

[3]ChoiYJ,ShinHS,ChoiHS,etal.UricacidinducesfataccumulationviagenerationofendoplasmicreticulumstressandSREBP-1cactivationinhepatocytes[J].LabInvest，2014，94(10):1114-1125

[4]梁衍鋒，張東東，孫俐俐，等. 姜黃素對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟SREBP-1cmRNA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2012,35(5)：7-8

[5]KangOH,KimSB,SeoYS,etal.Curcumindecreasesoleicacid-inducedlipidaccumulationviaAMPKphosphorylationinhepatocarcinomacells[J].EurRevMedPharmacolSci， 2013，17(19):2578-2586

[6]梁衍鋒，張東東，孫俐俐，等.姜黃素對非酒精性脂肪性肝病ApoB100與SREBP-1c的影響[J].中國老年學雜志，2013,33(21): 5381-5383

[7]王舒然, 陳炳卿, 王朝旭, 等. 靈芝孢子降血脂及抗氧化作用的研究[J]. 中國公共衛生學報, 1999,1(5): 263-265

[8]梁衍鋒,張東東,孫俐俐，等. 姜黃素和靈芝孢子對非酒精性脂肪性肝病ApoB100mRNA的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013,36(1)：39-40[9]Hortonetal.HortonJD,GoldsteinJL,BrownMS.SREBPs:activatorsofthecompleteprogramofcholesterolandfattyacidsynthesisintheliver[J].JClinInvest，2002，109:1125-1131

[10]LeclercqIA,FarrellGC,FieldJ,etal.CYP2E1andCYP4Aasmicrosomalcatalystsoflipidperoxidesinmurinenonalcoholicsteatohepatitis[J].JClinInvest, 2000,105(8):1067-1075

[11]XuYJ,YangQH,HanL,etal.EffectsofsoothingliverandinvigoratingspleenrecipesonSREBP-1c,SCD-1mRNAandproteinsexpressioninhepatocytesofNAFLDrats[J].ZhongYaoCai，2014，37(1):80-86

The effects of Curcumin and ganoderma lucidum on the expression of SREBP-1c mRNA in NAFLD

HANDong-dong1,ZHANGDong-dong2,ZHAOYun-he1,LIANGYan-feng2,JIANan1,BIBo1,ZHANGYang-yang1,HUANGRu2,XUYong-ji2,GUOMeng1,CAOQi-bo2,GONGTian-yu2,ZHANGLei1

(1.College of Clinical Medicine, Jiamusi University, Heilongjiang, Jiamusi 154002, China;2.College of Basic Medicine, Jiamusi University,Jiamusi 154007, China)

Objective: To investigate the relationship between sterol-regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c) and NAFLD in liver of mice interfered by curcumin and ganoderma lucidum. Methods: The expressions of SREBP-1c mRNA in liver were tested by RT-PCR in normal group, NAFLD model group, treatment group by curcumin and ganoderma lucidum. Results: The expression of SREBP-1c mRNA was increased in NAFLD model group, and decreased in treatment group by curcumin and ganoderma lucidum (P<0.05).TheexpressionofSREBP-1cmRNAwasnotsignificantlydifferentbetweentreatmentgroupbycurcuminandganodermalucidum(P>0.05). Conclusions: The expression of SREBP-1c mRNA was increased in NAFLD model group. There are not significant differences in the expression of SREBP-1c mRNA between curcumin and ganoderma lucidum.

non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD); curcumin; ganoderma lucidum; sterol-regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c)

佳木斯大學大學生科技創新項目，編號：XSYD2014-013；佳木斯大學大學生創新創業訓練計劃項目，編號：2014XJ23。佳木斯大學青年基金項目，編號：Sq2014-001。

韓東東(1993～)男，黑龍江大慶人，在讀本科學生。

梁衍鋒(1980～)女，黑龍江哈爾濱人，碩士，講師。E-mail:lyf_zdd@163.com。

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1008-0104(2015)03-0040-02

2015-01-20)