新型含Cu抗菌鈦合金體內(nèi)抗菌性的初步研究①

丁元圣,趙 王月,張宏偉,趙 剛

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

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新型含Cu抗菌鈦合金體內(nèi)抗菌性的初步研究①

丁元圣,趙 王月,張宏偉,趙 剛

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：本課題采用動物體內(nèi)對新型含Cu抗菌鈦合金的抗菌性的研究，為正畸種植支抗提供新型材料。方法：將表面染有金黃色葡萄球菌的含Cu鈦合金植入體與純鈦植入體分別植入新西蘭大白兔的肌肉內(nèi)。在術(shù)后的每1、4、7、14天，以大體觀察、細菌培養(yǎng)、白細胞計數(shù)的方法進行分析，驗證含Cu抗菌鈦合金的體內(nèi)抗菌性。結(jié)果：純鈦組可見比較嚴重的化膿反應(yīng)，大量細菌定植及炎癥細胞浸潤，白細胞升高明顯。含Cu鈦合金組愈合良好，個別可見輕微化膿反應(yīng)，細菌及炎癥細胞均好于純鈦組。結(jié)論：含Cu抗菌鈦合金，在體內(nèi)具有抗菌性。

含Cu抗菌鈦合金；體內(nèi)抗菌；研究

一種新型生物材料要應(yīng)用于臨床之前必須要經(jīng)過一系列嚴格地檢測與篩選，且要符合臨床要求具備一定的物理材料性能和良好的生物相容性[1]。本實驗選用的含Cu鈦合金已在前期通過體外抗菌實驗證實了該材料在體個具有優(yōu)秀的抗菌性能，通過細胞相容性試驗證明該材料無細胞毒性具有良好的生物相容性。為進一步的體內(nèi)實驗奠定理論基礎(chǔ)。有學(xué)者認為：在沒有考慮到微循環(huán)的中介過程中，不能將材料的細胞毒性試驗的結(jié)論直接推理到體內(nèi)的相容性[2]。因此在評價材料生物相容性是必須要進一步的進行動物體內(nèi)試驗。動物體內(nèi)試驗包括材料的皮下埋植、肌肉埋植和骨內(nèi)埋植試驗等。試驗中要觀察是否發(fā)生溶血反應(yīng)、毒性反應(yīng)和過敏反應(yīng)，觀察傷口局部的愈合情況等。在組織病理學(xué)方面，觀察不同時期的植入體周圍組織的反應(yīng)情況，如炎癥細胞數(shù)量和分類，植入物周圍的纖維變化、包膜厚度等。這些參數(shù)都是通常用來評價材料的生物相容性。本實驗通過體內(nèi)肌肉植入實驗和骨內(nèi)植入實驗的方式分兩個部分，分別來評價和驗證含Cu抗菌鈦合金的體內(nèi)抗菌性和骨相容性，為含Cu抗菌鈦合金的臨床廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用健康成年新西蘭大白兔24只，體重2～2.5kg。動物隨機分為兩組，每組又按照四個時間點分成四個小組，每小組3只，分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)。

材料：①含CU鈦合金②醫(yī)用純鈦，樣本加工成長10mm寬3mm厚1mm的薄片。樣本用金剛砂紙機械拋光至1200目后，噴砂、高溫蒸汽消毒。

實驗用菌液配制：用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別復(fù)蘇金黃色葡萄球菌凍干菌株，并培養(yǎng)后經(jīng)形態(tài)學(xué)及生化試驗鑒定為純培養(yǎng)物。采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次的新鮮菌液培養(yǎng)物，挑取金黃色葡萄球菌單菌落混懸于培養(yǎng)液中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,之后用血球計數(shù)板配制成1×105cfu/mL的菌液，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 手術(shù)操作：大白兔適應(yīng)飼養(yǎng)后，按照分組編號順序烏拉坦(5ml/kg)耳緣靜脈麻醉，固定于手術(shù)臺上，側(cè)臥位、備皮、局部消毒、利多卡因局部麻醉，在兔背脊單側(cè)骨骼肌區(qū)距離脊柱2cm處用手術(shù)刀做長約2cm的切口，顯露肌肉組織，再用止血鉗鈍性分離背部豎脊肌，形成袋狀，加樣槍加入1×105cfu/mL20μmL(覆蓋于整個實驗片表面)菌液與試驗片一同植入肌肉中，并確保其不與脊柱骨組織接觸。術(shù)后分層縫合傷口。傷口消毒，不給予抗生素注射。

1.2.2 實驗檢測：實驗按時間發(fā)為Day1.Day4.Day7.Day14

①觀察手術(shù)后動物的飲食、活動及傷口愈合情況(紅腫、硬結(jié)分泌物，新生肉芽組織，組織張力等)；實驗動物處死后觀察植入材料與周圍組織的關(guān)系，植入材料周圍的組織是否有化膿、壞死等情況；取出材料后，觀察植入材料表面是否完整、有腐蝕生銹、變色反應(yīng)等情況。

②白細胞計數(shù)：于耳緣血管，用EDTA抗凝管取血1～1.5mL，行血常規(guī)檢測白細胞數(shù)量。

③細菌培養(yǎng)：處死后切開實驗切口周圍組織鈍性分離，取試驗片上及片周圍包繞組織膿液均勻涂布于培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)24h。24h后，觀察菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后大體觀察可見，術(shù)后24h后實驗動物蘇醒飲食活動正常，第1天兩組傷口均見血凝塊形成炎癥對比情況不明顯。4d后純鈦組傷口個別可見膿液滲出并伴有白色膜狀增生，而后炎癥加劇，至14d時可見傷口處腫脹，個別經(jīng)觸傷口有白色膿塊流出。含Cu鈦合金組炎癥癥狀輕，初期可見紅腫，14d時已無任何癥狀，傷口愈合完好。取出的試驗片材料與組織無黏連、表面均無腐蝕生銹、變色反應(yīng)等情況。

2.2 白細胞計數(shù)

含Cu鈦合金組在1、4、7d與空白組存在差異，而在14d時已無顯著差異。說明術(shù)前相比炎癥反應(yīng)在白細胞數(shù)量上在第14天已無差異恢復(fù)正常值。純鈦組在1、4、7、14d均與術(shù)前有差異。在4、7、14d含Cu鈦合金組與純鈦組存在顯著差異，經(jīng)統(tǒng)計分析具有統(tǒng)計學(xué)意義。而在第1天兩組沒有顯著差異，推測可能的原因為術(shù)后切口急性炎癥期，使得二者在白細胞數(shù)量上無差異。見表1。

表1 含CU抗菌鈦合金組與醫(yī)用純鈦組白細胞計數(shù)結(jié)果(109)

*：合金組術(shù)后與術(shù)前有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01；◇：合金組與純鈦組有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05；◇◇：合金組與純鈦組有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01；：純鈦組中術(shù)后與術(shù)前有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01。

2.3 膿液細菌培養(yǎng)

細菌培養(yǎng)菌落數(shù)合金組明顯少于純鈦組，含Cu鈦合金在第1、4、7天可見零星菌落分布于培養(yǎng)皿中，14d時少見或無菌落。純鈦組在第1天時就有大量菌落定植，隨著天數(shù)增加菌數(shù)量呈指數(shù)增長，在14d達最高。兩組細菌培養(yǎng)菌落數(shù)差異顯著P<0.05，含Cu鈦合金組菌落數(shù)明顯少于純鈦組。

3 討論

本實驗中選用的含Cu抗菌鈦合金經(jīng)過前期的體外實驗，證明其在體外具有抗菌性能。研究證實，經(jīng)過第一次拋光對金黃色葡萄菌與大腸埃希氏菌的抗菌率為100%和99.93%，而經(jīng)過第二次和第三次拋光后對金黃色葡萄菌抗菌率為99.86%和100%，對大腸埃希氏菌的抗菌率為99.69%和99.25%，上述結(jié)果表明，此含Cu鈦合金的體外抗菌性能高不僅僅位于合金表面，而是具有整體的抗菌性[3]。通過體外細胞相容性實驗顯示，本實驗中的含Cu鈦合金無細胞毒性具有良好的細胞相容性[4]。所以，選擇以Cu作為抗菌金屬元素的Cu抗菌鈦合金作為實驗用植入體，用于本實驗中。含Cu鈦合金組的感染控制明顯優(yōu)于純鈦組，傷口邊緣愈合整齊。研究顯示細菌感染可使血液中白細胞增多，因此白細胞數(shù)量可作為了解細菌感染程度的輔助指標之一[5]。同時，炎癥反應(yīng)是機體 自身抵抗和修復(fù)的過程，與細菌感染密切相關(guān)，因此炎癥細胞的數(shù)量在一定程度上也可以反映機體細菌感染程度[6]。結(jié)果證實含Cu抗菌鈦合金在體內(nèi)植入初期就已具備抗菌性，能夠抑制細菌的增殖，有效的控制了炎癥發(fā)生與發(fā)展。炎癥反應(yīng)一般都發(fā)生于早期和短期內(nèi)，炎癥發(fā)生時機體本身的抵抗力也會對炎癥產(chǎn)生反應(yīng)，在短期或更長時間后，機體自身免疫力在可控范圍內(nèi)也可以將炎癥控制或消除，但耗費時間更長代價也更大，所以含Cu抗菌鈦合金實驗片在早期抗菌抗炎方面優(yōu)勢也就更具意義。本實驗通過體內(nèi)實驗驗證了其在體內(nèi)抗菌性能，但應(yīng)用于臨床還需要大量的實驗予以驗證。鈦及鈦合金已在臨床上得到了十分廣泛的應(yīng)用，保持鈦及鈦合金優(yōu)勢金屬原有的優(yōu)點，兼具有抗菌性能的抗菌鈦合金的發(fā)展將別具意義[7]。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號：LM2014-046。

丁元圣(1978～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

趙剛(1975～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail:5304404@qq.com。

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