人毛囊干細胞體外培養(yǎng)纖維連接蛋白鋪層最佳濃度的實驗研究

吳 巍，段惠川，曹誼林

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海 200011)

?

·論 著·

人毛囊干細胞體外培養(yǎng)纖維連接蛋白鋪層最佳濃度的實驗研究

吳 巍，段惠川，曹誼林△

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海 200011)

目的 探討最適合人毛囊干細胞體外培養(yǎng)及擴增的纖維連接蛋白(FN)鋪層濃度。方法 將新鮮FN稀釋至所需要的4個濃度：5 μg/mL、200 ng/mL、10 ng/mL、0 ng/mL。使用酶消化法分離人毛囊細胞，將原代人毛囊干細胞在不同濃度鋪層的培養(yǎng)皿中的細胞增值能力和克隆形成率進行統(tǒng)計分析，獲得最適合人毛囊干細胞體外培養(yǎng)的鋪層濃度。結(jié)果 接種同一樣本相同數(shù)量細胞，做克隆效率測定，在原代培養(yǎng)第8天做Giemsa染色，結(jié)果顯示0 ng/cm2鋪層的培養(yǎng)皿中克隆團小，數(shù)量少；10 ng/cm2鋪層的克隆團大，數(shù)量多；200 ng/cm2和5 μg/cm2鋪層的克隆團較小，數(shù)量不多。取10個樣本，分別對4個FN鋪層濃度的克隆效率進行統(tǒng)計分析，10 ng/cm2鋪層的克隆效率最高。在不同F(xiàn)N鋪層濃度條件下，細胞擴增能力也不同，10 ng/cm2鋪層濃度細胞擴增能力最強，與其他3個濃度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，200 ng/cm2與其余3個濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 10 ng/cm2的FN鋪層濃度效果最佳。

毛囊干細胞； 外根鞘； 組織工程； 纖維連接蛋白； 細胞培養(yǎng)

毛囊具有循環(huán)更新的能力，這種能力是由毛囊組織中的干細胞，即毛囊干細胞(HFSC)所產(chǎn)生[1]。有研究報道，毛囊干細胞不僅對于皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)有著再生和修復(fù)作用，還能在體外被誘導(dǎo)成骨、軟骨、脂肪、肌肉和神經(jīng)細胞，有望在未來被應(yīng)用于各類組織的修復(fù)[2-3]。但是毛囊干細胞，尤其是其在體外的培養(yǎng)和擴增還無特別有效的方法；提高毛囊干細胞在體外培養(yǎng)過程中干性(stemness)和增殖能力是其研究的基礎(chǔ)問題。細胞體外貼壁培養(yǎng)，影響細胞增殖和生物學(xué)特性的2個主要因素：一是培養(yǎng)皿(板)的鋪層，二是培養(yǎng)液。以往的研究主要通過3T3細胞作為飼養(yǎng)層(鋪層)從而改善毛囊干細胞在體外的環(huán)境；但是作為小鼠來源的3T3細胞容易混入所飼養(yǎng)的毛囊干細胞中，在未來人體應(yīng)用時帶來安全和倫理隱患。纖維連接蛋白(FN)是皮膚基底膜的主要成分之一，具有促進多種細胞黏附、細胞遷移和生長的作用，其對表皮角質(zhì)形成細胞黏附的促進作用要強于Ⅳ型膠原和層粘連蛋白[4]。使用FN作細胞鋪層，從理論上可模擬體內(nèi)環(huán)境下細胞與細胞外基質(zhì)接觸的狀態(tài)，為毛囊干細胞提供統(tǒng)一的類似生理狀態(tài)下的生長環(huán)境，可能為一種有效的手段，避免3T3作為滋養(yǎng)層所帶來的倫理學(xué)問題。因此，本研究旨在尋找最適合人毛囊干細胞黏附的FN鋪層濃度，這也是人毛囊干細胞體外培養(yǎng)研究的一個關(guān)鍵技術(shù)問題。報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 (1)儀器：去離子水系統(tǒng) (Millipore,美國)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific,美國)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠，中國)；離心機(Thermo,美國)；微量精密天平秤(Startorius,德國)；精密天平秤(Shangping,中國)；倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)；熒光顯微鏡(Nikon,日本)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)；冰箱(海爾，中國)；24孔板(BD Falcon,美國)；4孔板(BD Falcon,美國)；6孔板(BD Falcon,美國)； 10 cm 培養(yǎng)皿(BD Falcon,美國)；15 mL離心管(BD Falcon,美國)； 50 mL離心管(BD Falcon,美國)； 0.22 μm針頭濾器 (Millipore,美國)； 40 μm濾網(wǎng)(BD Falcon,美國)；顯微外科手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠，中國)；電動移液器(Jencons，英國)；Z2粒度計數(shù)儀(Beckman Coulter,美國)。(2)試劑：Human Fibronectin(BD，美國)；中性蛋白酶(Dispase，Roche,德國)；胰蛋白酶、熒光封片劑(Gibco，美國)；無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)基(K-SFM，美國)，添加表皮生長因子和牛垂體添加物、F12培養(yǎng)液(Gibco，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；維生素、 L-谷氨酰胺(Sigma，美國)；青霉素(上海新先鋒藥業(yè)有限公司，中國)；鏈霉素(華北制藥股份有限公司，中國)；腺嘌呤、氫化可的松、胰島素(Sigma，美國)；各類抗體。

1.2 方法

1.2.1 FN的配制方法和實驗分組 在無菌操作下，將FN粉末溶于PBS 中配制終濃度為100 μg/mL，共1 L，4 ℃保存，使用期限為1個月，每次鋪層時，新鮮FN稀釋至所需的4個濃度：5 μg/mL、200 ng/mL、10 ng/mL、0 ng/mL。

1.2.2 FN鋪盤 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入100 μL/cm2的FN溶液，搖晃培養(yǎng)皿至液體均勻鋪滿皿底；將培養(yǎng)皿放入4 ℃冰箱60 min或者過夜；負壓吸除FN溶液，置入37 ℃溫箱4～6 h，封口待用(1周內(nèi)使用)。

1.2.3 人毛囊外根鞘細胞的獲取與原代培養(yǎng) 手術(shù)(整形外科除皺手術(shù)或毛發(fā)移植術(shù))獲取的健康者頭皮樣本浸泡于添加雙抗的DMEM，4 ℃下保存不超過6 h。頭皮樣本采用氯霉素及PBS反復(fù)沖洗，在解剖顯微鏡下，剔除皮下脂肪組織，應(yīng)用手術(shù)刀將頭皮分剪成(0.25×0.25)cm2的小組織塊，加入用DMEM稀釋的12.5 mg/mL中性蛋白酶Ⅱ，4 ℃過夜；用顯微鑷子將表皮完整地去除，然后將完整的生長期毛囊從真皮中拔出，使用PBS沖洗，以防止表皮細胞或真皮細胞的污染。為了得到毛囊單細胞懸液，將取下的毛囊用0.05% 胰酶+0.02%EDTA在 37 ℃下消化15 min，然后用含有10% FBS的DMEM液終止消化。反復(fù)吹打后，將細胞懸液通過40 μm濾網(wǎng)得到單細胞懸液，并將細胞懸液600 r/min離心5min，棄上清液，加入新鮮K-SFM培養(yǎng)液，重懸細胞，計數(shù)。按照1×104/cm2的接種密度將細胞種入無鋪層的6孔板中，放入含5% 二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 無滋養(yǎng)層無血清培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)人毛囊干細胞及其傳代擴增 將消化所得的原代毛囊細胞按照1×104/cm2接種于事前鋪層好的4孔板中，采用無血清的角化上皮細胞培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)。當(dāng)細胞擴增到80%匯合時，以0.05% 胰酶消化細胞，37 ℃ 1～3 min，使用10% FBS終止消化，刮下細胞后收集細胞懸液離心(600 r/min，5 min)，棄上清液，加入新鮮K-SFM培養(yǎng)液，重懸細胞，計數(shù)。按照同樣的接種密度將細胞種入事前鋪層的培養(yǎng)皿中。放入含5% 二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照同樣方法傳代直至細胞停止擴增為止。

1.2.5 細胞計數(shù) 使用毛囊細胞培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞混勻后，吸出10 μL用血細胞計數(shù)板計數(shù)3次取平均值。每次傳代時采用血細胞計數(shù)板計數(shù)3次，取平均值。

1.2.6 Giemsa染色 取Giemsa染料3.8 g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨，逐漸加甲醇至375 mL，溶解后再加125 mL 純甘油，于37 ℃溫箱保溫48 h；在此期間搖動數(shù)次，放置1～2 周過濾，制成Giemsa儲存液(10×)。使用前，臨時配置Giemsa工作液：取1 mL 儲存液加入9 mL PBS，混勻后方可使用。吸干培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，加入4%多聚甲醛溶液室溫下固定10 min，吸除固定液后加入Giemsa工作液100 μL/cm2，室溫下靜置10～15 min后吸出工作液，PBS漂洗3～5次，晾干。

1.2.8 細胞增殖能力 將同一樣本的毛囊細胞原代按照1×104/cm2接種在不同F(xiàn)N濃度鋪層的培養(yǎng)皿中，K-SFM培養(yǎng)第8天時，用0.05%胰酶消化細胞，計數(shù)細胞數(shù)量(計數(shù)3次取平均值作為P0-D8的細胞數(shù))，通過公式分別計算出不同濃度FN鋪層的增殖能力。

1.2.9 免疫熒光鑒定 負壓吸除毛囊細胞培養(yǎng)液，加入37 ℃預(yù)熱的4%多聚甲醛溶液，室溫固定10 min；PBS漂洗3次，每次3 min；10%羊血清(或兔血清)室溫封閉30 min；加入1抗4 ℃孵育過夜；PBS漂洗3次，每次5 min；加入2抗，37 ℃孵育60 min；PBS漂洗3次，每次5 min；Hoechst 33342(1∶1 000)核襯染10 s或者DAPI(1∶500)核襯染10 s，PBS漂洗5 min 1次；熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察及拍攝照片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，使用Mann-WhitneyU檢驗,統(tǒng)計量為Z，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人毛囊干細胞的獲取與原代培養(yǎng) 經(jīng)酶消化后，所獲得的細胞接種于不同F(xiàn)N濃度鋪層的培養(yǎng)皿，20 min可見有部分細胞貼壁，大約在24 h后，大多數(shù)細胞已經(jīng)貼壁，呈圓形，沒有伸展，在第2～3天，貼壁細胞逐漸伸展，絕大多數(shù)細胞最終形成鋪路石樣的細胞，細胞較小，呈圓形或多角形，核漿比例小，胞核圓，細胞形成小的克隆團，但有極少量細胞呈橢圓形或梭形生長，5～7 d迅速生長成較大克隆團。見圖1。

圖1 不同濃度FN鋪層對人毛囊干細胞體外培養(yǎng)的影響

2.2 細胞克隆效率檢測4種不同濃度FN鋪層 接種同一樣本相同數(shù)量細胞，做克隆效率檢測，在原代培養(yǎng)第8天做Giemsa染色，結(jié)果顯示，0 ng/cm2的鋪層的培養(yǎng)皿中克隆團小，數(shù)量少；10 ng/cm2鋪層的克隆團大，數(shù)量多；200 ng/cm2和5 μg/cm2鋪層的克隆團較小，數(shù)量不多。取10個樣本，分別對4個FN鋪層濃度的克隆效率進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，10 ng/cm2鋪層的克隆效率最高。見圖2。

2.3 不同F(xiàn)N 濃度對人毛囊干細胞擴增能力的影響 在不同F(xiàn)N鋪層濃度條件下，細胞擴增能力也不同，經(jīng)統(tǒng)計分析提示，10 ng/cm2鋪層濃度細胞擴增能力最強，與其他3個濃度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，200 ng/cm2與其他3個濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 不同濃度FN鋪層對人毛囊干細胞克隆效率的影響

圖3 不同濃度FN鋪層對人毛囊干細胞體外擴增的影響

3 討 論

為了滿足組織工程構(gòu)建等對種子細胞數(shù)量的要求，尋找一種可以促進人毛囊細胞體外增殖但保持良好生物學(xué)性能的培養(yǎng)方法顯得十分重要。

以往的研究報道中較常用的是用抑制過的3T3細胞作滋養(yǎng)層、FAD作為培養(yǎng)基(其中添加很多細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì))培養(yǎng)毛囊干細胞的培養(yǎng)方法[5]。但是由于3T3是小鼠細胞，可能混入最終獲得的人毛囊干細胞，因此在倫理學(xué)和免疫排斥等方面都有不容忽視的問題。而以人成纖維細胞作為滋養(yǎng)層要求成纖維細胞應(yīng)在有絲分裂的后期，其技術(shù)更不易掌控，很難為每次傳代提供非常標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的滋養(yǎng)層條件[6-7]。

本組前一部分研究采用無血清、無滋養(yǎng)層的培養(yǎng)方法，但發(fā)現(xiàn)在該種培養(yǎng)體系過程中，CK15、FST、CK19等人毛囊干細胞標(biāo)志物陽性O(shè)RS細胞會迅速減少，這可能是本組所采用的KSFM無血清培養(yǎng)基不能提供毛囊干細胞所需的體外生長環(huán)境[8-10]。因此，本組使用改良該種培養(yǎng)方法，滿足人毛囊干細胞臨床應(yīng)用的需求。影響體外培養(yǎng)細胞生長有2個主要因素：一是培養(yǎng)皿(板)的鋪層，二是培養(yǎng)液。因此，本組首先采用對表皮類細胞黏附及增殖較為有效的FN來改善其鋪層。皮膚基底層主要由Ⅳ型膠原、FN、層粘連蛋白(laminin)等組成。其中FN作為皮膚基底膜的主要成分之一，能與細胞表面特異性受體以及細胞外基質(zhì)中其他大分子結(jié)合，對細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附以及細胞外基質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的組建起重要作用[11]。FN是一種大型的糖蛋白，存在于所有脊椎動物，分子含糖4.5%～9.5%，糖鏈結(jié)構(gòu)依組織細胞來源及分化狀態(tài)而異。FN可將細胞連接到細胞外基質(zhì)上。FN以可溶形式存在于血漿及各種體液中；以不溶形式存在于細胞外基質(zhì)及細胞表面。前者總稱血漿FN；后者總稱細胞FN。每條FN肽鏈約含2 450個氨基酸殘基，整個肽鏈由3種類型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的模塊(module)重復(fù)排列構(gòu)成。具有5～7個有特定功能的結(jié)構(gòu)域，由蛋白酶敏感的肽段連接。這些結(jié)構(gòu)域中有些能與其他ECM(如膠原、蛋白聚糖)結(jié)合，使細胞外基質(zhì)形成網(wǎng)絡(luò)；有些能與細胞表面的受體結(jié)合，使細胞附著ECM。FN肽鏈中的一些短肽序列為細胞表面的各種FN受體識別與結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。如在FN肽鏈中央與細胞相結(jié)合的模塊中存在RGD(Arg-Gly-Asp)序列，是細胞表面某些整合素受體識別與結(jié)合的位點[12]。

大量文獻報道顯示FN可以促進多種細胞黏附、增殖[13-14]。由于表皮類干細胞均坐落于基底膜上，只有在發(fā)生分化后逐漸與基底膜分離，向上遷移[15]。有研究者利用這一特征將未分選的表皮角質(zhì)形成細胞懸液接種于包被有Ⅳ型膠原、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等的培養(yǎng)皿上進行分選[16]。結(jié)果提示，在Ⅳ型膠原上黏附20 min后收獲的細胞占全部基底層細胞的10%；纖維粘連蛋白上黏附5 min后獲得的細胞占全部基底層細胞的28%；快速黏附于層粘連蛋白上的細胞克隆形成能力沒有明顯增加。人毛囊干細胞主要富集于人毛囊隆突部外跟鞘[17-18]。所以本組實驗選擇FN作為鋪層，觀察其是否促進ORS細胞的黏附和增殖，結(jié)果表明FN鋪層比不鋪層促進人毛囊ORS細胞黏附、增殖。由此認為，人FN鋪層可以作為一種有效的促進人毛囊干細胞黏附、增殖的方法，可代替3T3滋養(yǎng)層，避免傳統(tǒng)方法使用3T3滋養(yǎng)層培養(yǎng)人毛囊干細胞有異種細胞混入的一系列問題。

FN的常用濃度為5 μg/cm2，但是在使用該濃度時發(fā)現(xiàn)細胞黏附雖然較快，但是細胞形態(tài)變大，老化明顯，且不呈克隆樣生長。所以本實驗降低了FN濃度，并且比較了4個不同數(shù)量級FN濃度對人毛囊干細胞黏附和增殖能力的影響，取得最佳FN濃度范圍。但是FN的常用濃度5 μg/cm2不如10 ng/cm2適合毛囊干細胞的生長，這個原因尚有待于進一步研究。

[1]Alonso L,Fuchs E.The hair cycle[J].J Cell Sci,2006,119(Pt 3):391-393.

[2]Panagiotis M,Stelios T,Andreadis C.Hair follicle:a novel source of multipotent stem cells for tissue engineering and regenerative medicine[J].Tissue Eng Part B Rev,2013,19(4):265-278.

[3]Shan CC,Sung JL,Chih C C,et al.Therapeutic strategy for hair regeneration:hair cycle activation,niche environment modulation,wound-induced follicle neogenesis and stem cell engineering[J].Expert Opin Biol Ther,2013,13(3):377-391.

[4]Adams JC,Watt FM.Expression of beta 1,beta 3,beta 4,and beta 5 integrins by human epidermal keratinocytes and non-differentiating keratinocytes[J].J Cell Biol,1991,115(3):829-841.

[5]Hattori Y,Maitani Y.DNA/Lipid complex incorporated with fibronectin to cell adhesion enhances transfection efficiency in prostate cancer cells and xenografts[J].Biol Pharm Bull,2007,30(3):603-607.

[6]Evans AR,Euteneuer S,Chavez E,et al.Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay[J].Dev Neurobiol,2007,67(13):1721-1730.

[7]Limat A,Hunziker T,Boillat C,et al.Post-mitotic human dermal fibroblasts efficiently support the growth of human follicular keratinocytes[J].J Invest Dermatol,1989,92(5):758-762.

[8]Lyle S,Christofidou-Solomidou M,Liu Y,et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci,1998,111(Pt 21):3179-3188.

[9]Ohyama M,Terunuma A,Tock CL,et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].J Clin Invest,2006,116(1):249-260.

[10]Limat A,Hunziker T,Boillat C,et al.Post-mitotic human dermal fibroblasts efficiently support the growth of human follicular keratinocytes[J].J Invest Dermatol,1989,92(5):758-762.

[11]Hynes RO,Zhao Q.The evolution of cell adhesion[J].J Cell Biol,2000,150(2):89-96.

[12]Orly J,Sato G.Fibronectin mediates cytokinesis and growth of rat follicular cells in serum-free medium[J].Cell,1979,17(2):295-305.

[13]Huebsch JB,Fields GB,Triebes TG,et al.Photoreactive analog of peptide FN-C/H-V from the carboxy-terminal heparin-binding domains of fibronectin supports endothelial cell adhesion and spreading on biomaterial surfaces[J].J Biomed Mater Res,1996,31(4):555-567.

[14]Simpson KH,Bowden MG,Hook M,et al.Measurement of adhesive forces between sepidermidis and fibronectin-coated surfaces using optical tweezers[J].Lasers Surg Med,2002,31(1):45-52.

[15]Hardy MH.The secret life of the hair follicle[J].Trends Genet,1992,8(2):55-61.

[16]Adams JC,Watt FM.Expression of beta 1,beta 3,beta 4,and beta 5 integrins by human epidermal keratinocytes and non-differentiating keratinocytes[J].J Cell Biol,1991,115(3):829-841.

[17]Ohyama M.Hair follicle bulge:a fascinating reservoir of epithelial stem cells[J].J Dermatol Sci,2007,46(2):81-89.

[18]Panteleimon R,Valentina G.Stem cell dynamics in the hair follicle niche[J].Semin Cell Dev Biol,2014,30(1):34-42.

The experimental study of the most suitable for human hair follicle stem cell adhesion of fibronectin concentrations*

WUWei,DUANHui-chuan,CAOYi-lin△

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,ShanghaiNinthPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

Objective To find the most suitable for human hair follicle stem cell adhesion of fibronectin (fibronectin,FN) concentrations.Methods The fresh fibronectin diluted to the desired concentration.The experiment is divided into the following four concentrations:5 μg/mL,200 ng/mL,10 ng/mL,0 ng/mL.Using enzyme digestion isolated from human hair follicle cells,the original generation of value-added hair follicle stem cells and cloning efficiency in a dish with different concentrations of plies,statistical analysis ply concentration most suitable for human follicle stem cells cultured in vitro.Results The same number of cells seeded in the same sample,do the cloning efficiency was measured in the first eight days of primary culture do Giemsa staining results:dish plies 0 ng/cm2of cloned groups of small,small number; 10 ng/cm2Overlay dish,cloning large group and number,the smaller the dish 200 ng/cm2and 5 μg/cm2plies cloned groups a small number.Take 10 samples,respectively,four FN Overlay concentration cloning efficiency statistical analysis found that,10 ng/cm2overlay genomic clone for maximum efficiency.10 ng/cm2overlay the strongest concentration of cell proliferation,and the other three groups were statistically significant,200 ng/cm2and the rest 3 group of concentrations were not statistically different.Conclusion 10 ng/cm2concentration is the best FN overlay.

hair follicle stem cells; external root shealth; tissue engineering; fibronectin; cell culture

國家自然科學(xué)基金項目(31271046)。

吳巍，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事毛囊干細胞的實驗研究。△

，E-mail:caoyilin169@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.002

A

1672-9455(2015)12-1661-04

2015-01-25

2015-04-22)