HK型α珠蛋白生成障礙基因診斷及其家系分析

姚亞超，李 磊，李澤泳，李亞紅，李 楠，張 珍，嚴 芳，張 智△

(1.廣東省第二人民醫院檢驗醫學部，廣州 510317；2.廣州醫科大學附屬第三醫院生殖醫學中心/廣東省生殖醫學重點實驗室，廣州 510150)

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·論 著·

HK型α珠蛋白生成障礙基因診斷及其家系分析

姚亞超1，李 磊2，李澤泳1，李亞紅1，李 楠1，張 珍1，嚴 芳1，張 智1△

(1.廣東省第二人民醫院檢驗醫學部，廣州 510317；2.廣州醫科大學附屬第三醫院生殖醫學中心/廣東省生殖醫學重點實驗室，廣州 510150)

目的 建立HK型α珠蛋白生成障礙基因的分子診斷方法，為臨床產前診斷和遺傳咨詢提供指導。方法 單管多重Gap-PCR的方法檢測3種常見α缺失型珠蛋白生成障礙，PCR結合反向斑點雜交(RDB)技術檢測αCS、αQS、αWS3種α非缺失型珠蛋白生成障礙，巢式PCR檢測HKαα型α珠蛋白生成障礙。總結HKαα型α珠蛋白生成障礙基因型及臨床表型。比較HKαα型胎兒基因變異與家系關系。結果 在8 000例疑似α珠蛋白生成障礙患者中，HKαα型α珠蛋白生成障礙患者27例且存在3個HKαα家系，發現1例罕見的αQS和HKαα的混合雜合子(αQSα/HKαα)。結論 巢式PCR可檢測HKαα型α珠蛋白生成障礙，用于育齡夫婦的基因診斷和高風險胎兒的產前診斷。

α珠蛋白生成障礙； 產前診斷； 系譜； HKαα

α珠蛋白生成障礙是一種世界范圍的遺傳性血液病，主要發生在東南亞和中國的熱帶和亞熱帶區域[1]。我國廣西的α珠蛋白生成障礙攜帶率為17.55%,廣東為8.53%[2]。α珠蛋白生成障礙是α珠蛋白基因簇的缺失或者非缺失突變而引起的小細胞低色素性貧血，α珠蛋白基因簇的順序為：5′-ζ2-Ψζ1-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ-3′。α2和α1珠蛋白基因高度同源，包含3段同源性序列(X、Y、Z同源盒)；這3個同源盒由非同源區域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)截斷隔開[3]。

在我國南方珠蛋白生成障礙流行地區，--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα是最常見的幾種α珠蛋白生成障礙的缺失類型[2,4-5]。其他種類的α珠蛋白生成障礙，如--11.1/αα、-α27.6/αα、α珠蛋白基因多聯體(αααanti3.7和αααanti4.2)也被檢測出[6-8]。α珠蛋白基因的缺失或者增多是同源性或者非同源性重組的結果，常見α2和α1珠蛋白基因之間不平等交換可產生單個α珠蛋白基因的缺失(-α3.7和-α4.2)，以及對側重復的三聯體基因(αααanti3.7和αααanti4.2),這些突變均可通過Gap-PCR的方法檢測[9]。此外，在α珠蛋白基因簇區域有更為復雜的交換，可產生四聯體基因αααα、成組出現的α2和α1珠蛋白基因(α212和α121)、HKαα基因[10-15]。HKαα基因是-α3.7和αααanti4.2不等位交換形成，僅有極少數文獻報道[14-15]。本研究擬建立一種檢測HKαα的方法，通過產前診斷發現1例罕見αQS和HKαα的混合雜合子(αQSα/HKαα)，現對其進行驗證并進行其家系分析。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年12月至2014年8月廣東省第二人民醫院8 000例疑似α珠蛋白生成障礙患者的孕前咨詢夫婦、孕婦的資料。記錄受檢者姓名、性別、年齡等信息，血紅蛋白(Hb)電泳、血常規檢測結果資料和基因診斷結果，由廣東省第二人民醫院中心實驗室匯總后輸入Excel軟件數據庫中保存。

1.2 樣本采集 采集受檢者外周血3 mL，乙二胺四乙酸抗凝；胎兒標本均為羊水，每例分3管共抽取羊水10 mL。按磁珠法提取外周血標本的基因組DNA，羊水標本采用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)由雙人獨立提取雙份產前標本DNA。

1.3 血液學表型分析 采用細胞計數儀(X-2100，日本Sysmex公司)進行紅細參數分析；使用快速自動電泳分析系統(法國Sebia公司)進行Hb電泳及Hb組分定量檢測。

1.4 基因型分析 α珠蛋白生成障礙的分子診斷采用單管多重跨越斷裂位點聚合酶鏈反應(Gap-PCR)技術檢測3種常見α缺失型珠蛋白生成障礙；相關引物參照文獻[16]，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。采用Takara公司生產的LA酶配置PCR反應體系，反應條件：預變性 96 ℃ 5 mim；先進行10個循環：98 ℃ 45 s，62 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 3 min；再進行25個循環：98 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min；最后延伸 72 ℃ 10 min。見表1。PCR結合反向斑點雜交(RDB)技術檢測αCS、αQS、和αWS3種α非缺失型珠蛋白生成障礙。常規電泳檢測發現的特殊條帶標本，采用巢式PCR檢測出HK αα型珠蛋白生成障礙。Gap-PCR檢測常規α缺失后，擴增結果顯示-α3.7和α2基因，且-α3.7電泳條帶非常細弱，α2基因條帶濃粗時，經過2次電泳證實此現象，疑為HKαα基因存在。電泳結果顯示為-α3.7、α2基因、--SEA3個條帶時，同樣考慮HKαα基因存在，對可疑樣本再進行HKαα檢測。采用Takara公司生產的LA酶配置PCR反應體系，反應條件：預變性95 ℃ 5 mim；35個循環：97 ℃ 1 min，60 ℃ 2 min，72 ℃ 4 min；最后延伸 72 ℃ 10 min。將巢式PCR第1輪擴增產物稀釋1 000倍后，作為第2輪擴增的模板，采用Takara公司生產的LA酶配置PCR反應體系，反應條件：預變性 95℃ 5mim；35個循環：97 ℃ 1 min，60 ℃ 2 min，72 ℃ 4 min；最后延伸 72 ℃ 10 min。使用針對部分Z2+和Z1同源盒的引物(a2/3.7-F和3.7-R)來擴增HK αα基因；基因型為αα/αα和-α3.7/αα的標本在1.9 Kb位置處無相應條帶的出現。

2 結 果

2.1 HK型α地中海貧血基因的分子診斷結果 Gap-PCR檢測常規α缺失后，擴增結果顯示-α3.7和α2基因，且-α3.7電泳條帶非常細弱，α2基因條帶濃粗時，經過2次電泳證實此現象，疑為HKαα基因存在。電泳結果顯示為-α3.7、α2基因、--SEA3個條帶時同樣考慮HKαα基因的存在。選擇可疑標本2號和4號進行HK基因的驗證。電泳結果顯示各個組均擴增出α1基因位置處的同源盒序列。將第1輪的擴增產物稀釋1 000倍后作為第2輪擴增的模板，使用針對部分Z2+和Z1同源盒的引物a2/3.7-F和3.7-R來擴增HKαα基因，基因型為αα/αα和-α3.7/αα的標本在1.9Kb位置處無相應條帶的出現。見圖1。

2.2 基因診斷及血液學分析結果 8 000例基因分析確診的珠蛋白生成障礙患者中，HKαα型α珠蛋白生成障礙患者27例。27例HKαα型α珠蛋白生成障礙患者中，檢出HKαα/αα 19例、--SEA/HKαα 7例、αQSα/HKαα 1例；27例HKαα型α珠蛋白生成障礙患者存在3例HKαα家系。血液學分析結果顯示，HKαα/αα的血常規結果表現正常；--SEA/HKαα患者的血常規檢測結果表現為小細胞、低色素，但貧血癥狀較輕或無貧血。臨床癥狀較--SEA/αα嚴重，但沒有達到--SEA/-α3.7的嚴重程度[17]。見表2。

注：A圖為單管多重Gap-PCR方法檢測3種常見α缺失型珠蛋白生成障礙；1：-α3.7/αα；2：HKαα/αα；3：--SEA/-α3.7；4：--SEA/HKαα；5：正常對照；6：空白對照；7：SEA對照。B圖為第1輪PCR。C圖為巢式PCR檢測-α3.7條帶。

圖1 巢式PCR檢測HK αα片段電泳圖

表2 不同類型的α珠蛋白生成障礙患者的血液學資料分析

表3 3個HK型地中海貧血家系的血液學表型分析結果

2.3 產前診斷結果 產前診斷發現3個家系胎兒雜合子3例，其中1例為HKαα/αα；1例為αQSα/HKαα；另外1例為--SEA/HKαα。見表3、4。

表4 3個HK型地中海貧血家系基因診斷及產前診斷結果

3 討 論

缺失型α珠蛋白生成障礙是α珠蛋白基因的1條或2條因同源性或非同源性重組而丟失。非平衡交叉連接會產生多種復雜的缺失基因型，其中HKαα是一種極少見的非平衡交叉連接，表現為在同一條染色體上同時含有-α3.7缺失及αααanti4.2基因的交叉連接片段[14]。

基因型為HKαα/αα的患者易被診斷為-α3.7/αα，并且與健康者比較，HKαα/αα患者的α球蛋白mRNA水平無明顯差異[18]。本研究統計分析不同類型的α珠蛋白生成障礙患者的血液學資料，結果顯示HKαα/αα的臨床癥狀較-α3.7/αα輕很多；基因型為--SEA/HKαα的患者不表現為Hb H，僅表現為輕度珠蛋白生成障礙，Hb>100 g/L，與相關學者的報道一致[18-19]。而基因型為--SEA/-α3.7的患者由于缺失了3個α珠蛋白基因，臨床上表現為Hb H疾病，Hb<100 g/L。

本研究8 000例疑似α珠蛋白生成障礙患者中，HKαα型α珠蛋白生成障礙患者27例，陽性率約為0.34%，與廣西地區HK αα的攜帶率(0.07%)有較大的差異[18,20]，分析原因主要為標本選擇不同，本研究對象為篩查結果中疑似α珠蛋白生成障礙的患者，本組Hb A2的參考值為3.0%～3.5%，靜止型珠蛋白生成障礙臨床癥狀輕微者可在篩查實驗中檢出，從而得出較高的HKαα陽性率。對于HKαα型α珠蛋白生成障礙的較高的攜帶率，常規Gap-PCR檢測技術易將-α3.7誤診為HKαα，但HKαα型珠蛋白生成障礙的臨床表現不同于常見的α珠蛋白生成障礙，容易誤將輕度診斷為中重度，因此HKαα型α珠蛋白生成障礙的分子診斷和產前診斷十分重要。

本研究根據HKαα的發生機制，即存在不同同源盒部位的基因重組[14,18]，采用巢式PCR方法檢測HK型珠蛋白生成障礙，為后續基因診斷和產前診斷提供依據。本組證實HKαα基因的存在，但是HKαα的發生機制比較特殊，不能排除另外一條染色體合并-α3.7缺失的可能，患者確切的基因型需要進行家系分析。本研究表明產前診斷家系2的胎兒存在HKαα的同時，合并αQS點突變。與以往的報道[14-15,21]相比，αQSα/HKαα為首次發現的基因型，可將HKαα的檢測應用到產前診斷。

本研究對產前診斷保健的孕婦及其配偶都進行血液學表型篩查：血常規、Hb含量分析，對疑為α珠蛋白生成障礙表型陽性的患者，排除缺鐵性貧血的情況下(如平均紅細胞容積小于80 fL和平均紅細胞血紅蛋白含量小于27 pg，Hb<3.0%者)，按常規Gap-PCR技術檢測--SEA、-α3.7、-α4.2，若為陽性，則其配偶也需做相同基因分析。本組3個HK家系因夫妻雙方均為α珠蛋白生成障礙基因攜帶者，根據遺傳規律將會生育中重度珠蛋白生成障礙患兒，其出生會給家庭和社會帶來沉重的負擔，故育齡夫婦需開展HK型珠蛋白生成障礙表型篩查和基因診斷，同時為曾生育中重度珠蛋白生成障礙患者或者為中重度珠蛋白生成障礙風險胎兒的家庭進行遺傳咨詢和產前診斷。

本研究采用HKαα型珠蛋白生成障礙的分子診斷方法，成功地進行了3個HKαα家系的產前診斷。應用HKαα珠蛋白生成障礙的表型篩查和基因診斷技術，有助于我國α珠蛋白生成障礙高發區產前診斷水平的進一步提高。

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Molecular diagnosis and pedigree analyzation of HKαα thalassemia*

YAOYa-chao1,LILei2,LIZe-yong1,LIYa-hong1,LiNan1,ZHANGZhen1,YANFang1,ZHANGZhi1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,theSecondPeople′sHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou,Guangdong510317,China；2.DepartmentofReproductiveMedicineCenter,KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China)

Objective To establish a method for detection the genotype of HK in α-thalassemia and to provide a precise pregnant diagnosis and an effective genetic counseling for thalassemia (thal)．Methods The single tube complex PCR was used to detect 3 types of deletional α-thal．Reverse dot blotting(RDB)/PCR to detect 3 kinds of undeletional α-thal--αCS,αQSand αWSwhich were common in Chinese population．The method of two-round nested PCR assay is successfully established to detect the genotype of HK in α-thal.Then we collect the clinical data of the patients with the genotype of HK in α-thal and analyse the association between the genotype and hematological phenotype.Further,we analyse the relationship between fetal genotype variation and the pedigree.Results A total of 8 000 cases from Guangdong were undergone thal genotype genetic diagnosis．Among the 8 000 cases，27 cases were diagnosed as the genotype of HK in α-thal，including 3 pedigrees.We report the pregnant diagnosis results for which the parents had the same type of genotype.Moreover,the hematological phenotype data were collected.Conclusion The two-round nested PCR method could effectively detect the HK genotype in α-thal.Through careful molecular tests,one case of prenatal heterozygosity of αQSα/HKαα was identified，and the fetus is kept successfully through careful clinical counseling．

alpha-thalassemia； prenatal diagnosis； pedigree

國家自然科學基金項目(81400639)；廣州醫科大學博士啟動基金項目(2014C39)。

姚亞超，女，博士，主管技師，主要從事分子生物學研究。

△通訊作者，E-mail：yalw135@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.006

A

1672-9455(2015)12-1672-04

2014-12-20

2015-02-15)