內質網應激在大鼠重癥急性胰腺炎肝損傷的臨床意義

李 楊，趙 鵬，蘇 春，陳建立，劉 洋，張國志

(河北聯合大學附屬醫院，河北唐山 063000)

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·論 著·

內質網應激在大鼠重癥急性胰腺炎肝損傷的臨床意義

李 楊，趙 鵬，蘇 春，陳建立，劉 洋，張國志△

(河北聯合大學附屬醫院，河北唐山 063000)

目的 探討內質網應激相關分子葡萄糖調節蛋白78(GRP78)及CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)，是否參與大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)并發肝損傷的發生和發展。方法 采用5%牛磺膽酸鈉建立大鼠SAP肝損傷模型，將80只成年雄性SD大鼠隨機分為2組，假手術組(sham組)及模型組，各40只，每組又按時間點隨機分為3、6、12、24、36 h 5個組。采用全自動生化儀檢測血清淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的含量變化，HE染色觀察大鼠肝臟組織的形態學變化，免疫印跡(Western Blot)法檢測大鼠肝臟組織GRP78及CHOP的表達水平。結果 (1)模型組血清AMY、ALT及AST水平逐漸升高，且12 h達到峰值(P<0.05)；模型組比對應的Sham組血清酶水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。(2)HE染色結果顯示，肝臟在24 h時損傷最嚴重。(3)模型組GRP78及CHOP表達水平逐漸增加，且以24 h表達水平最高(P<0.05)；模型組比對應的sham組GRP78及CHOP表達顯著增多，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 SAP肝損傷發病中24 h最嚴重，GRP78及CHOP表達明顯增加，其可能參與SAP肝損傷的發生和發展。

內質網應激； 葡萄糖調節蛋白78； CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白； 重癥急性胰腺炎； 肝損傷

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床常見急腹癥之一，其病情兇險，病死率高，大多數SAP患者在胰腺出血、壞死的同時，伴有心、肝、肺、腎、胃、腸等器官損傷。其中，肝臟損傷在胰腺外器官損傷中發病率甚高，達88.9%。SAP并發肝損傷不但可以加重胰腺炎病情，而且容易引起多器官功能障礙,導致患者病死，病死率高達30%～40%[1]。眾多研究表明，SAP發病機制可能與炎性介質、氧自由基、線粒體應激及內質網應激有關。目前，內質網應激被認為是肝損傷發生過程中較重要的因子。

內質網應激(ERS)是指在各種不良情況下被破壞，功能發生紊亂，使大量錯誤折疊、未折疊蛋白在內質網腔內累積及鈣平衡紊亂的過程。當ERS時葡萄糖調節蛋白(GRP78)可以啟動未折疊蛋白反應(UPR)[2]，UPR具有增強內質網腔內蛋白折疊和降解的功能，并下調蛋白合成能力，減輕各種應激對細胞的損傷，使細胞適應當前環境而生存；但在持續而又嚴重的ERS過程中，UPR將不足以抵抗ERS，從而刺激細胞產生一系列促進細胞凋亡的蛋白，如CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)、Caspase-12，從而導致細胞凋亡[3]。近年來，關于ERS與各種因素造成的肝損傷的關系已有了一些研究報道，但SAP肝損傷與ERS的研究甚少?，F探討SAP并發肝損傷過程中ERS是否參與。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康雄性SD大鼠80只，體質量250～280 g(河北聯合大學實驗動物中心提供)。大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組(sham組)和模型組，各40只，各組又按時間點隨機分為3、6、12、24、36 h 5個組，每組各8只。

1.2 動物模型 術前12 h 禁食，自由飲水，采用10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g行腹腔內注射麻醉、固定。經上腹正中切口入腹,提起十二指腸及胰腺，沿胰膽管方向，尋找十二指腸大乳頭開口位置，于其開口略偏下對系膜緣腸壁上選一無血管區，使用24號一次性靜脈留置針進針，進入腸腔后拔出針頭3～5 mm，然后使導管前端貼系膜緣腸壁向乳頭開口方向緩慢滑行，探入胰膽管內，順其推進 5～7 mm 后，應用微型動脈夾分別夾閉十二指腸大乳頭開口及胰膽管肝門端。然后注射3%牛黃膽酸鈉1 mL/100 g，持續10 s，停留3 min,去除動脈夾，拔出留置針，分層縫合腹壁，造模成功，術后大鼠自由飲食、飲水。sham組僅打開腹腔，翻動胰腺組織后關腹。

1.3 主要試劑 牛磺膽酸鈉購于美國Sigma公司，水合氯醛購于天津歐博凱化工有限公司，CHOP、BiP Antibody購于美國Cell Signaling公司，β-Tublin、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、抗鼠IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Beyo ECL Plus均購于碧云天生物技術研究所，顯影劑D-72、定影劑D-72購于天津市世紀奧博商貿有限公司。

1.4 血清酶檢測 模型組及sham組分別于術后第3、6、12、24、36 h 再次麻醉,經原切口入腹，使用采血針從下腔靜脈采血3.5 mL,應用全自動生化儀檢測血清淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的水平變化。

1.5 HE染色 各組大鼠采血后，分別取部分肝組織于4%多聚甲醛溶液中固定，取部分肝組織凍存。4%多聚甲醛溶液固定的肝組織進行常規石蠟包埋切片，行HE染色，光鏡下觀察各時間點肝臟組織的病理學改變。

1.6 免疫印跡法(Western Blot) 將凍存肝組織研磨，加入組織裂解液(100 μL/100 mg)裂解蛋白，然后高速離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，留取上清液。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明檢測樣品蛋白濃度，計算上樣量。采用SDS-PAGE電泳，經硝酸纖維素膜轉移,10%脫脂奶粉封閉，加1抗，4 ℃搖床過夜?；厥?抗，PBS洗膜3次，10分鐘/次，加入相應2抗孵1.5 h，回收2抗，PBS洗膜3次，10分鐘/次。然后按照Beyo ECL Plus說明顯色，X光線膠片曝光。以β-Tublin孵育作為內參照。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清酶學檢測結果比較 模型組大鼠血清AMY、ALT及AST水平在建模成功后逐漸升高，于12 h達到峰值(P<0.05)，然后下降；模型組比相對應的sham組血清酶水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；sham組各時間點之間的血清酶水平無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠肝臟病理學變化 sham各組肝臟病理學無明顯變化，鏡下可見肝細胞大小形態正常，肝竇無擴張、淤血，肝小葉無水腫、壞死，匯管區無炎性細胞浸潤；3、6 h可見肝細胞輕度水腫，肝竇略擴張；12 h可見肝細胞水腫加重，胞漿呈顆粒狀，肝竇擴張、淤血；24 h肝細胞水腫進一步加重，出現氣球樣變，肝竇明顯擴張、淤血，炎性細胞浸潤，并且出現點狀或灶狀壞死；36 h時可見肝細胞水腫減輕，肝竇擴張、淤血有所減輕。提示SAP并發肝損傷于24 h損傷最嚴重。見圖1。

2.3 SAP肝損傷后GRP78、CHOP的含量變化 模型各組GRP78及CHOP的表達水平逐漸增多，且以24 h表達水平最高，差異有統計學意義(P<0.05)；模型各組比相對應的sham各組GRP78及CHOP表達水平明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組6、12、24、36 h比相對應的sham各組CHOP的表達水平明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。sham各組之間GRP78及CHOP表達水平，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 各模型組大鼠肝臟組織病理變化(HE，×400)

檢測項目3h6h12h24h36hAMY(模型組)1067．6±123．62299．5±333．35400．5±349．94757．0±320．83538．9±329．8AMY(sham組)645．0±84．5654．5±80．2656．4±78．1650．0±88．5650．1±82．0ALT(模型組)112．6±11．8275．1±19．4405．1±11．0317．9±12．3213．9±13．5ALT(sham組)44．3±3．646．6±3．646．9±3．146．6±3．744．5±2．9AST(模型組)224．6±22．7436．0±35．4634．8±32．5451．0±34．3394．3±33．3AST(sham組)126．0±13．3126．3±11．5128．0±12．2127．0±12．1125．6±13．6

圖2 各組大鼠GRP78及CHOP的表達情況

3 討 論

本組血清酶檢測結果顯示，隨著SAP病情的發展，血清AMY、ALT及AST逐漸升高，于12 h達到高峰，之后降低。肝組織病理學顯示，肝細胞逐漸水腫，發生氣球樣變，肝竇逐漸充血、淤血，匯管區大量炎性細胞浸潤，并且肝局部出現點狀或片狀壞死，于24 h最嚴重，然后有所好轉。提示本組成功制造SAP肝損傷的模型。

UPR通路是ERS激活信號轉導通路中重要的一條通路，其主要由GRP78及肌醇酶1(IRE1)、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)、活化轉錄因子6(ATF6)組成[4]。當發生ERS時，GRP78分別從IRE1、PERK、ATF6分離，從而使這3個ERS感受蛋白活化[5]?；罨腅RS感受蛋白一方面使GRP78表達增多，增強內質網對未折疊、錯誤折疊蛋白的處理能力[6]；另一方面使CHOP的表達上調，而CHOP高表達能夠誘導細胞凋亡。因此當過強或長時間的ERS將可能會通過激活CHOP途徑導致細胞凋亡。Fu 等[7]研究表明，敲除CHOP基因可使細胞避免出現內質網應激誘導的細胞凋亡。說明ERS可通過CHOP的高表達誘導細胞凋亡。

本實驗蛋白水平研究表明，隨著SAP肝損傷病情的發展，ERS相關蛋白GRP78及CHOP的表達逐漸大量增加，于24 h達到高峰，之后有所降低。這與肝臟病理學結果一致，提示ERS可能通過GRP78及CHOP促進肝細胞凋亡，參與SAP肝損傷的發生、發展。GRP78于24 h之后表達有所降低，可能是因為當CHOP表達到一定水平，啟動細胞凋亡通路對其具有抑制作用[8]；而CHOP表達減少可能是因為CHOP進一步與Tribbles同源蛋白3 (TRB3)基因上的啟動子區域結合，誘導TRB3表達，TRB3能夠通過負反饋機制抑制CHOP表達[9]。因此，本組推測GRP78的表達高峰可能在24 h之前，其具體的機制以及ERS其他相關蛋白在SAP肝損傷過程中的具體作用，仍需進一步研究。

綜上所述，SAP肝損傷于24 h損傷最嚴重；ERS可能參與SAP肝損傷的發生、發展。

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The funcation of endoplasmic reticulum stress in rat severe acute pancreatitis-associated liver injury

LIYang,ZHAOPeng,SUChun,CHENJian-li,LIUYang,ZHANGGuo-zhi△

(AffiliatedHospital,HebeiUnitedUniversity,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To observe the changes of endoplasmic reticulum stress-related molecules glucose-regulated protein 78 (GRP78) and CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein (CHOP) in the severe acute pancreatitis-associated liver injury and to discuss whether endoplasmic reticulum stress (ERS) participate in the progress of severe acute pancreatitis-associated liver injury.Methods The subject established the model of severe acute pancreatitis-associated liver injury by 5% sodium taurocholate.80 male SD rats were randomly divided into sham groups(n=40)and model groups(n=40).Then each groups were randomly divided into 3h,6h,12h,24h and 36h according time points.The changes of serum amylase (AMY),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were detected by automatic biochemical analyzer.Pathological changes of the liver were observed with HE staining.The expression of GRP78 and CHOP were detected by Western blot.Results (1)The level of serum enzyme were significantly increased and reached the peak value at 12h in model groups(P<0.05).The level of serum enzyme in the model groups were significantly increased compared with corresponding time points of sham groups (P<0.05).(2)The HE staining showed that the injury of the liver was the most serious at 24 h.(3)Western blot test showed that the expression of GRP78 and CHOP in the model groups were significantly increased and reached the peak value at 24 h(P<0.05).The expression of GRP78 and CHOP in the model groups were significantly increased compared with corresponding time points of sham groups(P<0.05).Conclusion The injury of the liver was the most serious at 24h and ERS may be involved in the progress of severe acute pancreatitis-associated liver injury.

endoplasmic reticulum stress； glucose-regulated protein 78； CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein； severe acute pancreatitis； liver injury

李楊，男，研究生，醫師，主要從事普通外科研究?！?/p>

，E-mail：qavipzhxp123@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.024

A

1672-9455(2015)12-1720-03

2014-12-22

2015-02-15)