東莞市不育男性精子功能檢查參數的分析

伍玉燕等

[摘要] 目的 分析東莞地區不育男性患者精子功能相關檢查結果。 方法 隨機選取本院25～44歲300例診斷為男性不育患者（不育組）與200名正常生育男性（對照組）精液標本，比較兩組精子形態學分析、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測及進行去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗的受精指數的差異，并將各項指標與不育進行相關性分析。 結果 不育組精子正常形態百分率（3.00±2.30）%，對照組精子正常形態百分率（8.00±4.30）%，差異有統計學意義（P<0.05）。不育組精子頂體酶活性為（69.40±31.50）?IU/106精子，對照組精子頂體酶活性（93.50±32.70）?IU/106精子，差異有統計學意義（P<0.05），不育組DNA碎片率（20.94±1.00）%，對照組DNA碎片率（11.27±0.79）%，差異有統計學意義（P<0.05）。不育組與對照組中去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗受精指數差異無統計學意義（P>0.05）。各種檢查結果與不育的相關回歸分析結果是，精子正常形態率與不以呈負相關（r=-0.823，P<0.05）、頂體酶活性與不育呈負相關（r= -0.723，P<0.05），與不育呈正相關的有頭部畸形率（r=0.894，P<0.05）、DNA碎片率（r=0.778，P<0.05）。 結論 精子形態分析、頂體酶活性、精子DNA碎片檢測是檢測精子功能的有效指標。精子正常形態率、頂體酶活性與不育呈負相關關系，與不育正相關的有頭部畸形率、DNA碎片率。

[關鍵詞] 不育；精子形態；DNA碎片檢測；去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗；頂體酶活性

[中圖分類號] R698.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）24-18-04

The value of sperm function parameters analysis for male infertility in Dongguan city

WU Yuyan CHEN Limei WANG Bin LIU Zhigang CHEN Huinan

Department of Reproductive Medicine，Dongguan People's Hospital of Guangdong Province，Dongguan 523000，China

[Abstract] Objective To study the sperm function parameters of male infertility in Dongguan city. Methods According to the difference of the reproductive function，semen samples randomly selected and divide to two groups（25-44 years old）：300 cases of male infertility（infertility group） and 200 normal fertile men（control group）.Compare of two groups the sperm morphology index，acrosomal enzyme index，sperm DNA fragmentation index and fertility index in Zona free hamster oocyte human sperm penetration assay（SPA）.And study the parameters correlation to infertility. Results The difference of the normal sperm morphology rate was significant（P<0.05）with the infertility group（3.00±2.30）% vs the control group（8.00±4.30）%.The acrosomal enzyme index in infertility group was（69.40±31.50）?IU/106 sperm，vs the control group（93.50±32.70）?IU/106sperm，the difference was statistically significant（P<0.05）.DNA fragmentation Index in infertility group was（20.94±1.00）% vs the control group（11.27±0.79）%，with statistical significance（P<0.05）.The fertilization index between two groups in SPA had no statistical difference（P>0.05）.The normal morphology rate（r=-0.823，P<0.05）and acrosomal enzyme（r=-0.723， P<0.05）are in negative correlation to infertility，and head deformity rate（r=0.894，P<0.05）and DNA fragmentation rate（r=0.778，P<0.05）are in positive correlation with infertility. Conclusion The index of sperm morphology，acrosomal enzyme，DNA fragmentation have high clinical application value for evaluating male semen quality.The normal sperm morphology rate and acrosomal enzyme are in negative correlation to infertility，while head deformity rate and DNA fragmentation rate are in positive correlation with infertility.endprint

[Key words] Infertility；Sperm morphology；DNA fragmentation index；Zona-free hamster oocyte human sperm penetration assay（SPA）；Acrosomal enzyme

男性不育癥，是指單純因為男性因素所導致的正常性生活，未采取避孕措施一年未能使配偶懷孕。隨著男方因素導致的不育比例越來越多，早期

診斷病因對治療男性不育癥尤其重要，以往對于臨床醫師來說，男性不育的檢測指標僅有精液常規分析，這些檢測項目固然為男性不育癥的診治提供了有價值的資料，可是未能反映精子全面的功能狀態，目前研究最多精子功能檢查為精子形態學檢查、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測及進行去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗，但國內外尚無廣泛臨床應用，基本是作為實驗研究，其正常值范圍寬泛，且少有不育人群與正常人群的臨床對照報道，因此嚴重影響到受精功能的評估。本研究通過對比東莞市不育男性與正常生育男性的精子功能相關檢查的結果：精子形態學檢查、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測及進行去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗，分析其與不育的關系，旨在希望獲得甄選檢測精子生育能力比較可靠的指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2013年9月～2014年6月生殖醫學科門診就診的25～44歲生育期的男性作為研究對象，平均年齡（32.0±4.8）歲，按照根據生育功能差異分為不育組300例，平均年齡（33±5.2）歲，對照組200例，平均年齡（31.0±4.9）歲，兩組的一般資料對比差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

不育組的入選標準：（1）依據WHO標準規律性生活未避孕一年不孕，并排除女方因素（包括女方年齡>35歲、輸卵管因素、排卵問題、宮頸因素等）的男性患者；（2）未服用過影響精子功能的藥物；（3）對照組的標準是為1年內令配偶正常受孕，自愿或有償愿意提供精液檢測的男性。

1.2 標本采集

檢驗者要求規范取精：禁欲2～7d，取精前先清潔雙手，本研究取精房內通過手淫法留取全部精液標本于潔凈無菌的一次性采精杯中，不得以安全套或中斷性交方式留取精液，輕輕混勻，待其在37℃環境溫度下20～30min完全液化后進行精子功能實驗室檢測。

1.3 方法

1.3.1 精液形態學參數計算方法 采用拉薄技術，Diff-Quick法染色，精子形態類型標準依據世界衛生組織（WHO）《人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室手冊》（第5版）[1]，嚴格按照標準進行精子形態學分析，分為頭部畸形、中部畸形、尾部畸形，將形態學處于臨界狀態的精子均列為異常精子。100倍油鏡下觀察200個精子形態并記錄，計算正常形態精子百分率。

1.3.2 采取改良Kennedy法檢測頂體酶活性值 采集新鮮精液完全液化后，根據精子密度計算標本量，得到精子量約7.5×106個；標本離心2000g×20min，棄去精漿，加入抑制劑100?L，反應液100μL，混勻后于24℃孵育lh，倒入0.5cm比色皿，分光光度計波長410nm下讀取數值，頂體酶活性=（測定管OD值-對照管OD值）×106/247.5×7.5。

1.3.3 采取精子染色質擴散試驗（sperm chromatin dispersion test，SCD）檢測精子DNA碎片率 精液標本洗滌后加入平衡后與瓊脂糖混勻，混合物滴于玻片上，冷卻后酸液洗去除核蛋白，酶解液消化后脫水干燥，使用DAPI進行熒光染色，熒光顯微鏡觀察，去除核蛋白后，精子染色質結構松散，DNA環附著于殘留的核結構，形成光暈。正常的精子DNA產生擴散的光暈，而損傷的精子DNA則不產生或產生很小的光暈。記錄DNA完整率、碎片率。

1.3.4 去透明帶倉鼠人精子穿透實驗（SPA） 可用卵子受精率與受精指數作為評估參數，受精指數更常用。卵子受精率=受精卵子數/卵總數×100。受精指數（fertilization index，FI）：由于透明帶已去除，一個卵子可被多個精子穿透。FI為穿透卵子的精子總數與卵子總數之商，從整體上反映精子的穿透力與頂體反應，可按下式計算：FI=穿入卵子的精子總數/卵子總數。

1.4 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，組間比較用t檢驗。以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。采用Logistic回歸進行相關性分析。

2 結果

2.1 兩組精子形態參數比較

2.2 兩組精子頂體酶活性、DNA碎片率、FI參數比較

不育患者中，頂體酶活性為（69.40±11.50）?IU/106

精子，正常生育男性頂頂體酶活性為（93.50± 42.70）μIU/106精子，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 不育與精子形態及精子功能指標相關性回歸分析

精子正常形態率、頂體酶活性、卵子受精率、受精指數與不育呈正相關關系，與不育負相關的有頭部畸形率、STD、STI、DNA碎片率。

3 討論

在正常育齡夫婦中，不育癥的發病率約為10%～15%，其中單純因男方原因所致不育者可達40%以上。東莞市雖是一個地區市，但人口眾多，不孕不育夫婦隊伍龐大，使得男性不育的實驗室檢查顯得尤為重要。既往男性不育的檢測指標僅有精液常規分析以及內分泌檢查，這些檢測項目固然為男性不育癥的診治提供了有價值的資料，可是未能反映精子全面生育能力。人精-卵融合通常在體內（IVF-ET除外）才能發生，對于體內受精過程來說，精子首先須經頂體反應獲能后才能穿透卵子，其過程復雜。精-卵受精機制雖已基本闡述明白，但是臨床上目前這方面國內外沒有通用評估檢測指標，因此要全面研究精子的生育能力，需要進行更進一步相關功能檢查。目前研究最多的為精子形態學檢查、頂體酶活性、精子DNA碎片檢測及進行去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗。endprint

一般認為，正常形態精子率越低，精子頭部畸形率越高，男性的生育能力也就越差。本研究結果顯示對照組精子正常形態率為（8.00±4.30）%和不育組正常形態率（3.00±2.30）%相比，差異有統計學意義，回歸分析表明，正常形態率與不育是負相關關系，頭部畸形率與不育是正相關關系。因此可知精子形態學檢查是評估精子手段的另一有效的補充，因操作方便，因此可廣泛應用于臨床，對每一位不育夫婦，均應將常規精液檢查與精子形態學檢查相互結合作為一線檢查手段。同時，我們觀察到無論對照組或不育組，正常精子形態率均較WHO第4版診斷標準低，因此第5版診斷標準更實用于當今男性精子功能評估，但也說明東莞市男性精子出現普遍生育力下降的現象，可能與本地區工業水平高污染嚴重有關。

從20世紀70年代，人類已經開始頂體酶與不育的研究，頂體酶是受精過程中重要的蛋白水解酶，通常以無活性頂體酶原形式存在于精子頂體內膜及赤道部膜上，當精子頭部進入卵透明帶時，頂體酶原被活化為頂體酶水解卵透明帶，使精子穿過卵透明帶最終與卵子融合。本研究結果對照組精子頂體酶活性（93.50±32.70）?IU/106精子，不育組精子頂體酶活性為（69.40±31.50）?IU/106精子，差異有統計學意義（P<0.05），表明男性不育癥患者的精子頂體酶活性低于正常生育男性的精子頂體酶活性，是判斷精子生育力很有價值的一項指標[2-4]。

既往研究表明，男性不育可能與精子DNA損傷緊密相關，本研究結果與不育正相關的精子DNA斷裂水平高于生育男性[5]。有研究發現有精液指標正常的特發性不育患者。其精子DFI也增高[6]。精子DNA碎片其發生機制尚不完全清楚，一般認為與精子發生過程中異常的染色質包裝、氧壓脅迫或凋亡異常有關，最常用的檢驗方法為精子染色體擴散實驗[7]。有研究報道精子DNA碎片化程度與IVF和胞漿內單精子注射（ICSI）的受精率呈顯著負相關，DNA碎片化的精子形成原核障礙導致受精率降低，當DNA碎片化的精子比例超過10%時，受精率明顯降低。精子DNA碎片化會導致不育、反復流產和助孕成功率低[8-10]。本研究中不育組精子DNA碎片率比正常生育男性的高，但影響不育的機制尚未完全明了，可對不育組最后需要行體外受精-胚胎移植技術助孕的患者提供最終受精資料。

去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗[11]用容易獲得的去掉透明帶的倉鼠卵代替人卵，把人精子與去透明帶倉鼠卵子混合，培養觀察受精的百分比評價精子受精能力，國外多數實驗室報道結果時以低于10%～15%卵受精率為異常，已被證實是評價精子授精能力的一種可靠技術，但其操作比較復雜，影響其大范圍開展。去透明帶倉鼠卵人精子穿透實驗包含獲能和頂體反應兩個過程的，本研究結果示不育組卵子受精指數值均與正常生育男性組差異無統計學意義（P>0.05），這與其他文章的結果不一致，可能的原因是本研究的不育組男性可能不存在獲能與頂體反應異常問題。

本研究分析精子功能參數與不育的相關回歸分析結果是，精子正常形態率（r=-0.823，P<0.05）、頂體酶活性（r=-0.723，P<0.05）與不育呈負相關關系，與不育正相關相關的有頭部畸形率（r=0.894，P<0.05）、DNA碎片率（r=0.778，P<0.05）。從數據顯示，精子正常形態率尤其是頭部畸形率對不育的相關性更強，對不育的治療方案的選擇指導意義更大。

總之，本研究結果顯示精子形態分析、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測被證明是檢測精子功能的有效指標，操作簡單，應廣泛臨床應用，結合精子常規檢查能為不育男性的治療方案（自然受孕、人工授精、體外受精-胚胎移植技術）[12-14]提供更有效、全面的根據，為患者提供有效、經濟、簡單的助孕方案。

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（收稿日期：2014-12-01）endprint