HSP70在先天性白內障小鼠晶狀體上皮細胞中的表達及意義

王 萍，蔡小軍，朱 怡，熊 期，張 菁，李朝輝，余愛華

(武漢大學中南醫院，湖北 武漢 430071)

論 著

HSP70在先天性白內障小鼠晶狀體上皮細胞中的表達及意義

王 萍，蔡小軍，朱 怡，熊 期，張 菁，李朝輝，余愛華

(武漢大學中南醫院，湖北 武漢 430071)

目的 探討熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)70在先天性白內障小鼠模型晶狀體上皮細胞中的表達及意義。方法 先天性白內障BALB/c-Cat小鼠為實驗組，正常BALB/c小鼠為對照組，每組16只。將實驗組與對照組均各取8只分別進行Western blot蛋白印跡法和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測小鼠眼睛晶狀體上皮細胞中HSP70及HSP70基因的表達水平，以β-actin作為內參校正，比較2組間HSP70表達的差異。結果 HSP70在小鼠晶狀體上皮細胞的相對表達值實驗組為0.105 0±0.041 4,對照組為0.188 7±0.023 6，2組比較差異有統計學意義(t=4.972 0，P<0.01)；小鼠晶狀體上皮細胞HSP70基因的相對表達值實驗組為0.131 3±0.003 5，對照組為0.334 0±0.004 2,2組比較差異有統計學意義(t=37.026，P<0.01)。結論 HSP70在先天性白內障小鼠病情的發生、發展中能起一定的細胞保護作用。

先天性白內障；晶狀體上皮細胞；熱休克蛋白HSP70；BALB/c小鼠

先天性白內障是導致兒童失明的主要原因之一，在發達國家其發病率為1～4/10 000萬，在發展中國家其發病率為5～215/10 000萬，全世界有13萬～20萬雙側先天性白內障患者致盲，并正以每年2萬～4萬/年的速度遞增[1]。先天性白內障能導致嬰幼兒失明或弱視，其中失明兒童中有22%～30%為先天性白內障所致，已成為兒童失明的第二位原因[2]。先天性白內障是由于胚胎時期晶狀體代謝發生異常而導致其自身透明度下降的疾病[3]。染色體異常為先天性白內障主要致病原因，已經發現多種基因的突變體與臨床及動物實驗性先天性白內障發生有關。由于蛋白質才是各種生命活動真正的執行者，基因是不能解釋一切的，隨著蛋白質檢測技術的發展，先天性白內障的研究也將進入蛋白質的研究階段。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是生物體(或離體培養細胞)在不良環境因素作用下所產生的一組具有高度保守性的應激蛋白[4]，其作為ATP依賴的分子伴侶可以輔助新合成的多肽進行正確的折疊、多蛋白復合物的聚合以及蛋白質通過膜的轉運，同時HSP70通過抑制應激時蛋白質分子的錯誤折疊，修復或降解損傷的蛋白，從而協助組織細胞的恢復，維持內環境穩定，促進細胞的生存[5]。本研究以Crygc基因突變的先天性白內障小鼠為模型，探討HSP70在先天性白內障小鼠模型晶狀體上皮細胞中的表達及其意義。

1 實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗動物 先天性白內障BALB/c-Cat小鼠16只，鼠齡2～3周，雌雄不限，體質量50～100 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。正常BALB/c小鼠16只，鼠齡2～3周，雌雄不限，體質量50～100 g，購自武漢大學動物實驗中心。實驗前2組小鼠均進行散瞳，并進行裂隙燈檢查排除角膜病及葡萄膜、玻璃體疾病。

1.1.2主要試劑及儀器 鼠抗人單克隆單體HSP70和Actin (深圳晶美生物制品公司)，Westem blot檢測試劑盒(美國cellsignaling公司)，Trizol試劑(Invitrogen 公司)，HSP70及β-actin基因引物(Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成)；PCR儀(美國PE公司)，離心機(Heal Force公司 )， PCR檢測系統(上海宏石醫療科技有限公司)，超凈工作臺(蘇凈安泰)，電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon-1600R型凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)，裂隙燈，顯微鏡，顯微器械。

1.2方法 購買后的小鼠環境適應時間為1周。 給予10%水合氯醛腹腔內注射(3 mg/kg),麻醉后，將小鼠頸椎脫臼致死，在顯微鏡下摘除雙側眼球，并用生理鹽水進行沖洗；置于冰浴中，剪除角膜、虹膜，摘出完整之晶狀體，生理鹽水沖洗；分離出晶狀體囊膜，因單個晶狀體囊膜HSP70表達含量較少且不穩定，所以將2個晶狀體囊膜合并放入1.5 mL Ep冷凍管，于液氮瓶下保存。采用Western-blot蛋白印跡法檢測2組小鼠眼睛晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70蛋白的表達，按照常規方法完成SDS-PAGE凝膠的灌制和分離蛋白的電轉移，印跡膜片與上述的一抗及HRP標記的二抗相繼孵育后，經過反復漂洗，與化學發光試劑溫育，經X射線片曝光顯現特異的蛋白信號，將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值，以β-actin作為內參校正，行半定量分析。采用RT-PCR法檢測2組小鼠服睛晶狀體囊膜上皮細胞HSP70基因的表達，RT-PCR條件：55 ℃逆轉錄30 min，94 ℃預變性3 min，94 ℃持續30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行30個PCR循環后72 ℃ 7 min。取5 μL PCR產物進行0．8%瓊脂糖電泳，以Kodak 2 000凝膠成像系統對擴增條帶進行密度掃描和分析。以151 bp β-actin作為內參照，并按照下列公式計算HSP70的相對表達值：被檢測基因表達值=被檢測基因光密度/β-actin光密度。

2 結 果

2.12組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70蛋白表達情況 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞上HSP70蛋白均有表達，見圖1。其中實驗組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70蛋白的相對表達值明顯低于對照組(t=4.972 0，P<0.01)，見表1。

E為實驗組，C為對照組。

表1 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70蛋白表達情況±s)

注：①與對照組比較,P<0.01。

2.22組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70基因表達情況 HSP70基因在2組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞上的表達情況見圖2，HSP70基因和內參β-actin分別擴展基因片段，1～2為對照組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞上HSP70基因的擴展產物，3～8為實驗組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞上HSP70基因的擴展產物，2組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞上HSP70基因的擴展產物約為255 bp。圖像分析儀測量瓊脂糖凝膠上HSP70/β-actin的平均灰度，結果實驗組HSP70基因相對表達值明顯低于對照組(t=37.026，P<0.01)，見表2。

圖2 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70的表達情況

表2 2組小鼠晶狀體囊膜上皮細胞中HSP70基因表達情況

注：①與對照組比較，P<0.01。

3 討 論

機體在正常生理應激和病理狀態下，都可激活一組基因——熱休克基因，產生具有高度保守性的氨基酸序列及其編碼基因所表達的蛋白質，即HSPs，以增強保護機體自身細胞免受應激因子的損傷的作用，其在原核細胞及真核細胞中均廣泛存在。HSPs對生物體在嚴酷環境下的生存起重要作用，又名應激蛋白[6]。HSPs種類繁多，現已發現10多種，目前尚無明確的分類標準，主要的HSPs可分為4個家族，即HSP90家族(分子量為83～90 kD)、HSP70家族(分子量為66～78 kD)、HSP60以及小分子量HSP家族(分子量為12～43 kD)[7]。其中HSP70是HSP大家族中的重要成員，它在正常細胞中有基礎性表達，表達水平比較低，而在應激后表達顯著增高。HSP70作為主要的分子伴侶之一，在維持機體正常的生理活動中起了重要的作用。由于晶狀體無血管供給營養，也沒有神經支配，各種應激因子均可對其造成損害，并影響晶狀體的正常代謝。當晶狀體蛋白質發生變性或其結構出現異常，不溶性蛋白質或異常蛋白質會增加，透明晶狀體發生混濁，導致白內障。在混濁晶狀體中不可溶性蛋白質增加，可能是由于HSP70的缺乏或缺陷造成，缺氧及滲透性應激可導致晶狀體蛋白的展開和分解并導致晶狀體混濁，ATP和HSP幫助展開的蛋白質重新折疊，但如果這一層防御措施失效，則變性蛋白將被消化或細胞進入凋亡途徑，在此過程中HSP促進其消化或凋亡[8]。Li 等[9]研究顯示，HSP70可以通過抑制線粒體細胞色素C的釋放及Caspase-3 的活化而抑制細胞凋亡。目前醫學界對HSP70在許多組織及疾病中的作用進行了廣泛的研究，國內很多學者都對HSP70在年齡相關性白內障發生發展中的作用進行了研究，結果均提示老年性白內障中HSP70含量明顯高于正常對照組，推測在老年性白內障中，細胞發生氧化損傷后，誘導產生更多的HSP70，以此發揮其細胞保護、分子伴侶、調節凋亡及抗氧化等方面的重要作用[7]。最終形成的白內障則可能由于負性影響大于保護因素所致。

本實驗以BALB/c-Cat小鼠為先天性白內障模型。BALB/c-Cat小鼠于2006年12月在大規模生產(BALB/C♂×ICR♀)F1代小鼠時發現，經10個世代回交，通過白內障雜合子小鼠自交，培育成先天性白內障近交系小鼠，呈常染色體顯性遺傳，同時將其命名為BALB/c-Cat小鼠[10]。2009年上海東華大學發現該白內障小鼠是由于Crygc基因發生突變而導致的。Crygc基因是小鼠γ-C晶狀體蛋白的編碼基因，γ-C晶狀體蛋白是晶狀體的重要結構蛋白。Crygc基因位于小鼠1號染色體的D1Mit236和D1Mit19之間約11 cM內，BALB/c-Cat小鼠Crygc亞基第3個外顯子的209 bp處缺失一個堿基。該突變在Crygc亞基第3外顯子的76位引入終止密碼子，使正常蛋白質丟失了15個氨基酸，第二結構域中的保守區被破壞、變短，形成截短蛋白，保守序列對維持蛋白質的結構和功能是相當重要的，變短則影響了晶狀體蛋白的功能，導致蛋白結構不穩定，突變后縮短的γ-C晶狀體蛋白可能失去與其他分子間正常的相互作用，或導致本身的不溶解性[11]。在蛋白質三維結構分析中，突變型蛋白的C-末端缺失一個β-折疊。β-折疊結構也是蛋白質構象中經常存在的一種結構方式，對于晶狀體而言，β-折疊有利于其形成球狀的結構，因此當其失去時，多肽鏈空間的伸張失去平衡，正是由于γ-C晶狀體蛋白的結構和功能發生了改變，導致晶狀體內發生了上述一系列的改變，引發白內障[11]。

本實驗結果顯示HSP70和HSP70基因在先天性白內障小鼠和正常小鼠的晶狀體上皮細胞中均有表達，且先天性白內障小鼠的表達均低于正常小鼠，推測HSP70在先天性白內障小鼠的晶狀體上皮細胞中表達減少，可能對白內障的形成起到一定的作用。其機制可能是Crygc基因突變后，機體產生一定的應激反應，HSP70應保護細胞應對這一反應。而缺失的HSP70導致細胞或生物從各種應激中恢復的能力下降，降低了細胞對損害的耐受程度，從而不能有效地保護它們免遭這些應激因素的損害，影響了細胞正常代謝。HSP70不僅可以與新生、未折疊的正常蛋白質結合，輔助新合成的多肽鏈折疊，還可以與錯折疊或聚集的蛋白質相結合，使某些蛋白質解離，減少不溶性聚集物的產生。同時HSP70的缺失導致機體不能將某些變性蛋白及時降解和清除，并且延緩了正常蛋白質合成的恢復。Crygc基因突變后，γ-C晶狀體蛋白縮短，HSP70的缺失使其不能幫助γ-C晶狀體蛋白進行正確的折疊，影響了γ-C晶狀體蛋白肽鏈的伸展狀態，增加了γ-C晶狀體蛋白的不溶解性。在這兩大方面的因素的綜合影響下，小鼠晶狀體蛋白質發生變性，不溶性蛋白質增多，透明晶狀體出現混濁，從而導致白內障發生。

本實驗力求從蛋白質水平對先天性白內障形成原因進行初步探討，進一步為先天性白內障的防治工作提供新視野。隨著對HSP70研究的不斷深入，HSP 70在先天白內障上的應用價值也將不斷被開發出來。可以把HSP70具有的抗氧化應激、分子伴侶、細胞保護作用應用到先天性白內障的防治上，這是一項值得深入探討的課題，擁有極為廣闊的前景。但本研究對HSP70在先天性白內障小鼠晶狀體上皮細胞中降低的分子機制方面還不明了，將在接下來的工作中做進一步的研究與探討。

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Expression and significance of HSP70 in congenital cataract lens epithelial cells of mice

WANG Ping, CAI Xiaojun, ZHU Yi, XIONG Qi, ZHANG Jing, LI Zhaohui, YU Aihua

(Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China)

Objective It is to approach the expression of heat shock protein 70 (HSP70) in lens epithelial cells (LECs) in mice model of congenital cataract and clarify the effect of HSP70 on pathogenesis of congenital cataract. Methods The lens capsule membrane in mice was chose as the research object, there was 16 cases (32 eyes) of normal BALB/c mouse in control group, and 16 cases (32 eyes) of congenital cataract BALB/c-Cat mouse in experimental group. The expression of HSP70 protein and HSP70 gene was assayed using Western blot method of protein imprinting and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method in the two groups of mice eye lens epithelial cells. Using β-actin as the confidential reference items for correction, the differences of HSP70 expression was compared between the two groups. Results The relative values of HSP70 expression to β-actin is 0.105 0+0.041 4 in congenital cataract LECs, while is 0.188 7+0.023 6 in normal control group, there was significant different in the expression of HSP70 between the two groups (t=4.972 0,P<0.01). The relative expression value of HSP70 gene is 0.131 3±0.003 5 in the experimental group and 0.334 0±0.004 2 in the normal group, there was significant difference between them (t=37.026,P<0.01). Conclusion HSP70 is associated with the occurrence and development of congenital cataract and it plays an important role in the cytoprotection.

congenital cataract; lens epithelial cells; heat shock protein 70, BALB/c mice

王萍，女，碩士，研究方向為白內障發生機制與治療。

蔡小軍，E-mail：xiaojuncai86@yahoo.com.cn

湖北省自然科學基金資助項目(2012FFB04324)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.001

R-332

A

1008-8849(2015)06-0571-04

2014-09-10