鴉膽子油乳制劑對宮頸癌Hela細胞的抑制效果及作用機制研究

羅 琦，楊 靜

(武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430000)

鴉膽子油乳制劑對宮頸癌Hela細胞的抑制效果及作用機制研究

羅 琦，楊 靜

(武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430000)

目的 探討鴉膽子油乳制劑對宮頸癌Hela細胞的抑制效果及作用機制。方法 觀察不同濃度(5，10 μg/mL)鴉膽子油乳處理Hela細胞后的形態改變;檢測不同濃度鴉膽子油乳(2.5，5，10，20，40 μg/mL)處理后對Hela細胞的抑制率，并觀察鴉膽子油乳處理濃度分別為10，20 μg/mL時細胞周期的變化情況。結果 鴉膽子油乳處理宮頸癌Hela細胞后出現凋亡小體,且細胞毒作用隨時間延長毒性增強；在處理48 h后，研究組的抑制率均>60%,72 h后抑制率均>80%;伴隨鴉膽子油乳濃度的增加,G0～G1期細胞比率降低,S期及G2～M期細胞比率明顯增加。10 μg/mL和20 μg/mL鴉膽子油乳處理48 h后細胞凋亡率分別為60%與70%。結論 鴉膽子油乳能夠明顯抑制宮頸癌Hela細胞的增殖,且呈時間依賴性,能夠誘導細胞凋亡,且使Hela細胞阻滯于S期。

宮頸癌Hela細胞;鴉膽子油乳;抑制增殖;巴氏染色;細胞凋亡

宮頸癌為女性常見的生殖道惡性腫瘤,手術聯合放化療是臨床上常用的有效治療方法。但大部分放化療藥物均具有較大的毒副作用,給宮頸癌女性帶來了嚴重傷害，故探尋一種毒副作用小的輔助放化療藥物迫在眉睫。鴉膽子油乳提取于苦木科植物鴉膽子成熟果實,其主要富含油酸與亞油酸。鴉膽子油乳對腫瘤細胞生長具有顯著的抑制作用,臨床上用于配合腫瘤的放化療過程,具有一定的增效減毒功效[1-3]。本研究觀察了鴉膽子油乳處理宮頸癌Hela細胞后的形態及生長周期等的變化情況,旨在探討鴉膽子油乳對Hela細胞的抑制效果及機制,為該藥物進一步應用于宮頸癌的臨床治療提供科學的理論依據。

1 實驗資料

1.1試劑與藥品 鴉膽子油乳購自沈陽藥大藥業有限責任公司, 胰蛋白酶與小牛血清均由沈陽寶信生物制品有限公司提供,宮頸癌Hela細胞株為本實驗室長期保存,3-(4,5-二甲基噻-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)、碘化丙啶(PI)、RPMI 1640培養液與二甲基亞砜(DMSO)等均購自美國西格瑪公司。

1.2Hela細胞培養 將凍存的Hela細胞進行復蘇,使用含10%小牛血清的RPMI1640培養液進行培養,設定溫度為37 ℃,將其置于CO2飽和濕度為5%的培養箱中,配置含有0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰酶進行消化并傳代培養。

1.3鴉膽子油乳處理Hela細胞后的形態觀查 將傳代24 h且生長狀態良好的細胞分為對照組、研究一組與研究二組,對照組不加鴉膽子油乳,研究一組與研究二組中分別添加5，10 μg/mL的鴉膽子油乳。使用倒置顯微鏡密切觀察Hela細胞的生長狀況。處理48 h后，分別收集3組Hela細胞,使用甲醛進行固定,用Harris蘇木精染液、EA36染液、橙黃-G6染液及梯度濃度乙醇進行巴氏染色,查看Hela細胞的形態變化情況。

1.4MTT法分析鴉膽子油乳作用于Hela細胞的效果 設計5個不同濃度的鴉膽子油乳(2.5，5，10，20，40 μg/mL)的研究組與陰性對照組,陰性對照組不加鴉膽子油乳。通過MTT法對細胞增殖抑制率進行檢測。將處于對數生長期的細胞移至96孔板中,各孔細胞液均為200 μL,細胞數量約1×104個,設定溫度為37 ℃,濃度為5%的CO2飽和濕度下繼續培養24 h。再將藥物分別加進研究孔內,設定6個復孔,進行24，48及72 h培養,各孔添加20 μL的MTT,孵育4 h后,棄去上清液,加入150 μL DMSO后勻速振蕩10 min,在波長為490 nm處使用酶標儀測定光密度(D)。細胞生長抑制率(%)=(1-研究組D/對照組D)×100%。

1.5鴉膽子油乳處理Hela細胞后的細胞周期檢查 將傳代24 h后生長狀態良好的Hela細胞分成正常細胞對照組與研究1組與研究2組。對照組中不添加鴉膽子油乳,研究1組、研究2組中分別加入質量濃度為10，20 μg/mL的鴉膽子油乳。再進行孵育48 h,按時取不同處理的Hela細胞,分析單細胞懸液,計數細胞數在1×109L-1以上,使用PBS徹底清洗后進行離心,再加入-20 ℃預冷后的無水乙醇進行30 min固定。經離心后將乙醇棄去,再用PBS進行洗滌,再加入400 μL的碘化丙啶溶液,4 ℃處理20 min后使用流式細胞儀進行檢測。

2 結 果

2.1鴉膽子油乳處理后Hela細胞的形態學觀察 鴉膽子油乳濃度與細胞生長密度成反比,正常的多邊形細胞中異形細胞數目變多。鴉膽子油乳處理12 h后，細胞體積縮小,生長密度降低,生長受到抑制,皺縮細胞數目增多,上述現象研究二組比研究一組更為明顯。隨著處理時間繼續延長,大量無規則且膨大細胞從瓶壁上脫落最終降解為細胞碎片。巴氏法染色后發現對照組的細胞輪廓清晰,胞膜邊界完整,各細胞間的結構十分緊密，見圖1。研究一組的Hela細胞體積縮小并皺縮,細胞間基本無連接, 核為溶解狀態,染色質朝向核膜聚集并顯示出凝塊狀態,部分細胞呈發泡狀的凋亡小體。研究二組同樣可見染色質濃縮及邊緣化,可清晰顯示出染色質固縮于核膜周邊,出現發泡狀態的凋亡小體，見圖2。

圖1 對照組Hela細胞形態(400×)

圖2 研究組Hela細胞形態(400×)

2.2鴉膽子油乳處理Hela細胞后抑制細胞增殖情況 相同濃度的鴉膽子油乳處理Hela細胞24，48，72 h后,細胞抑制率比較差異有統計學意義(P均<0.01)。相同時間點,不同濃度間的細胞抑制率略微增高,但差異無統計學意義。鴉膽子油乳處理Hela細胞后的細胞毒作用隨時間延長毒性增強,在處理48 h后研究組的抑制率均>60%,72 h后抑制率均>80%。見表1。

表1 鴉膽子油乳處理Hela細胞后抑制細胞增殖情況

2.3鴉膽子油乳處理Hela細胞后對細胞周期影響 伴隨鴉膽子油乳濃度的增加,G0～G1期細胞比率降低,S期和G2～M期細胞比率明顯增加。研究1組和研究2組細胞凋亡率分別為60%與70%。見表2。

3 討 論

宮頸癌是臨床常見的惡性腫瘤,近年來全球宮頸癌的發病率與病死率呈現出日益增長之勢，特別是處于生育期的女性所占比例最大, 據統計,10%～15%的宮頸癌發生在育齡階段[4]。在歐洲國家的一些女性，在生育前即被診斷出患有宮頸癌,而有些手術措施不能保留生育能力[5-6]。

表2 鴉膽子油乳處理后對細胞周期的影響 %

注：①與0 μg/mL濃度比較，P<0.05。

鴉膽子油乳主要由油酸與亞油酸組成,在抗腫瘤與增強機體免疫力方面效果顯著[7]。鴉膽子油乳與腫瘤的放化療聯合使用已應用于肝癌[8]、胰腺癌[9]、肺癌[10]、腦瘤[11]、食管癌[12]等各類惡性腫瘤;還能夠治療由HPV所導致的尋常疣、扁平疣、尖銳濕疣以及喉乳頭狀瘤等,但是將該藥應用于宮頸癌治療則鮮有報道。本研究旨在研究鴉膽子油乳對宮頸癌Hela細胞的抑制效果,結果顯示鴉膽子油乳在體外可以顯著抑制宮頸癌Hela細胞的增殖,而且鴉膽子油乳處理Hela細胞后的細胞毒作用隨時間延長毒性隨之增強,在處理48 h后研究組的抑制率均>60%,72 h后抑制率均>80%。

細胞凋亡出現異常與腫瘤的發生及發展密切相關,大多數化療藥物都是通過誘導腫瘤細胞凋亡來發揮作用的。王芳等[13]的研究顯示鴉膽子油乳可以誘導HL-60腫瘤細胞發生凋亡。本研究結果顯示,鴉膽子油乳處理Hela細胞后,細胞核固縮,染色質出現濃縮聚集在核膜下,呈半月狀,最終形成凋亡小體。而且通過流式細胞儀檢測表明,鴉膽子油乳在10 μg/mL和20 μg/mL濃度下對Hela細胞均出現凋亡峰。上述結果均證實鴉膽子油乳抑制Hela細胞增殖的作用機制可能是誘導Hela細胞進入了凋亡程序。

細胞周期中存在幾個檢查點即調定點,其中以G1～S期轉換與G2～M期轉換最為關鍵。因為基因組的穩定性差,腫瘤細胞可以通過上述2個關鍵的檢查點,故而體現出細胞周期運行失控的特點,最終導致腫瘤細胞無限增殖以及細胞分化受阻。有報道顯示,一般G2～M檢查點被認為對腫瘤治療的敏感性起決定性作用[14]。本研究應用鴉膽子油乳處理Hela細胞,使其細胞周期分布發生變化,伴隨藥物濃度的不斷增加,S期與G2～M期細胞數量也顯著增加,G0～G1期細胞數明顯減少,表明鴉膽子油乳阻滯S期轉為G2～M期,使腫瘤細胞分裂能力下降,抑制腫瘤細胞的增殖。總之,鴉膽子油乳誘導細胞凋亡并將其阻滯于S期,能夠有效抑制宮頸癌Hela細胞的增殖。

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Study on the inhibition effect and the mechanism of brucea javanica oil emulsion preparation in cervical cancer Hela cells

LUO Qi, YANG Jing

(Wuhan University School of Basic Medicine Sciences, Wuhan 430000, Hubei, China)

Objective It is to observe the inhibitory effect of Brucea javanica oil emulsion preparation on cervical cancer Hela cells, and approach its mechanism. Methods The morphology change of Hela cell after treated with different concentrations (5, 10 μg/mL) of brucea javanica oil was observed. The inhibition rate of Hela cells after treatment by different concentrations (2. 5, 5, 10, 20, 40 μg/mL) of brucea javanica oil emulsion on Hela cell were detected, and the change of cell cycle of Hela cell treated by 10 and 20 μg/mL of brucea javanica oil emulsion was observed. Results Apoptotic bodies was founder after treatment of brucea javanica oil emulsion in cervical cancer Hela cells, and the cytotoxic effect was increased with prolonged time; each group had more than 48% of inhibition rate after treated 48-hour,, and more than 80% after 72-hour; with the increase of brucea javanica oil emulsion concentration, the ratio of G0to G1phase cells was decreased, S phase and G2to M phase cell ratio were increased significantly. The cell apoptosis rate after treated with 10 and 20 μg/mL of brucea javanica oil emulsion for 48-hour were 60% and 70%. Conclusion Brucea javanica oil emulsion can obviously inhibit the proliferation of cervical cancer Hela cells, and was time dependent, it can induce cell apoptosis, and arrest the Hela cell cycle in S phase.

cervical carcinoma Hela cell; brucea javanica; proliferation inhibition; Papanicolaou staining; cell apoptosis

羅琦，女，主管藥師，研究方向為新藥研究與評價、抗腫瘤藥物藥理和藥物毒理學。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.002

R965

A

1008-8849(2015)06-0574-03

2014-09-01