Slug、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鱗狀細胞癌侵襲轉移中的作用

姜琳娜，路三軍，桂紅武，魏 娉，楊學麗，尹 峰

(河北省邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002)

Slug、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鱗狀細胞癌侵襲轉移中的作用

姜琳娜，路三軍，桂紅武，魏 娉，楊學麗，尹 峰

(河北省邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002)

目的 觀察Slug、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及基質金屬蛋白酶(MMP-9)在食管鱗狀細胞癌中的表達情況，探討Slug在食管鱗狀細胞癌細胞侵襲及轉移中的機制。方法 免疫組化法檢測70例食管鱗狀細胞癌組織、17例癌旁不典型增生組織及20例正常食管黏膜組織中Slug、E-cadherin、Vimentin、MMP-9的表達情況。結果 Slug、Vimentin、MMP-9 在食管鱗狀細胞癌中高表達，顯著高于正常食管黏膜，且隨著惡性程度升高表達增加；E-cadherin在癌組織中表達降低(P<0.05)。在食管癌組織中Slug與Vimentin、MMP-9表達呈正相關(P均<0.05)，與E-cadherin表達呈負相關(P<0.05)。結論 Slug 轉錄因子通過誘導食管癌細胞EMT的發生及上調MMP-9的表達，在食管癌的發生發展以及癌細胞的浸潤和繼發轉移中發揮重要作用。

食管鱗狀細胞癌；Slug；基質金屬蛋白酶-9;上皮-間充質轉化；波形蛋白

The role of Slug, E-cadherin, Vimentin and MMP-9 in the invasion and metastasis of

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞在某些生理或病理因素的作用下，失去細胞極性，轉化為間質細胞，同時伴有細胞形態與相關基因表達的改變。研究證實，EMT在組織纖維化及腫瘤的侵襲轉移過程中發揮重要作用[1]，許多上皮來源腫瘤細胞發生EMT后，表現為癌細胞與癌細胞之間黏附性下降，發生解離，侵襲能力增強[2]。Slug 是Snail 鋅指轉錄因子超家族成員之一，其在惡性腫瘤的浸潤及繼發轉移中起到重要作用[3]。本研究采用免疫組化法，通過檢測Slug及 E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase 9 ，MMP-9)在食管鱗狀上皮不典型增生、食管鱗狀細胞癌及正常對照組織中的表達情況，探討Slug在食管鱗狀細胞癌細胞侵襲及轉移中的機制，旨在為今后以Slug基因為靶向的食管癌治療提供理論依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取我院2012—2014年手術切除食管鱗狀細胞癌的標本70例，另取癌旁3 cm以內經病理證實為鱗狀上皮中-重度不典型增生的組織標本17例，遠端正常食管黏膜20例作為對照。70例食管癌患者術前均未進行免疫治療、放療及化療，且未發現其他器官腫瘤。標本病例中男40例，女30例；年齡45～77(64.6±6.60)歲；高分化16例，中分化36例，低分化18例。

1.2主要試劑 兔抗人Slug多克隆抗體購自北京博奧森公司，兔抗人E-cadherin、Vimentin、MMP-9多克隆抗體、即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒及DAB顯色試劑均購自福州邁新公司。

1.3實驗方法 所有組織用10%甲醛溶液進行固定，進行組織脫水、石蠟包埋。將制備好的石蠟組織切片脫蠟水化，高溫修復抗原，分別滴加一抗Slug、E-cadherin、Vimentin、MMP-9，Slug濃度為1∶100，其余為工作液，4 ℃孵育過夜后滴加二抗，室溫下孵育30 min，滴加DAB顯色液，蘇木素復染后常規脫水封片。試驗中用已知陽性的組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4結果判定標準 Slug以細胞核和/或細胞質出現棕黃色或黃色顆粒為陽性細胞， E-cadherin以胞膜和/或胞質中出現棕黃色或黃色顆粒為陽性細胞，Vimentin、MMP-9以胞質中出現棕黃色或黃色顆粒為陽性細胞。每張切片觀察10個高倍視野(×400)，每個視野計數100個腫瘤細胞，根據陽性細胞染色強度評分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比評分：≤10%為1分，11%～25%為2分，26%～75%為3分，76%～100%為4分。將細胞染色程度計分與陽性百分數計分相乘即為綜合評分，1～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，6～8分為陽性()，9～12分為強陽性()，分值≥3即可定為陽性。

1.5統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析。樣本率的比較采用2檢驗，并將2個不同指標行Speraman相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Slug、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鱗狀細胞癌、食管鱗狀上皮不典型增生及正常食管黏膜中的表達 免疫組化染色顯示Slug在正常食管黏膜中表達很低，在不典型增生及鱗狀細胞癌組織中表達升高，Slug陽性表達主要定位于胞核與胞漿，以胞漿表達為主，見圖1及圖2；其在食管鱗狀細胞癌組織中表達明顯高于不典型增生組織(P<0.05)，且隨著分化程度降低表達增加。E-cadherin陽性表達主要位于胞漿及包膜，以包膜表達為主，其在正常食管黏膜中高表達,食管鱗狀上皮不典型增生及鱗狀細胞癌中表達降低，見圖3及圖4；其在食管鱗狀細胞組織中的表達低于不典型增生組織(P<0.05)，且隨著分化程度的降低表達減少。Vimentin陽性表達主要位于胞質，在正常食管黏膜表達低，在不典型增生及食管鱗狀細胞癌中表達明顯升高，見圖5及圖6；其在食管鱗癌組織中表達明顯高于不典型增生組織(P<0.05)，且隨分化程度降低表達增加。MMP-9陽性表達主要位于胞漿，且表達主要位于腫瘤細胞侵襲的邊緣，其在正常食管黏膜中表達低，在不典型增生及食管癌中表達升高，見圖7及圖8；其在食管癌中表達高于不典型增生組織(P<0.05)，且隨分化程度降低表達增加。見表1。

圖1 Slug在正常食管黏膜中的表達(MaxVisionTM法,100×)

圖2 Slug在食管鱗狀細胞癌中的表達(MaxVisionTM法,100×)

圖3 E-cadherin 在正常食管黏膜中的表達(MaxVisionTM法,100×)

圖4 E-cadherin在食管鱗狀細胞癌中的表達(MaxVisionTM法,100×)

2.2Slug與E-cadherin、Vimentin及MMP-9表達相關性 Spearman等級相關分析顯示，Slug蛋白與E-cadherin的表達呈負相關(r=-0.283，P<0.05)，Slug蛋白與Vimentin的表達呈顯著正相關(r=0.354，P<0.01)，Slug蛋白與MMP-9的表達呈正相關(r= 0.244，P<0.05)，見表2。

3 討 論

食管癌是食管黏膜上皮或腺體發生的惡性腫瘤，其中侵襲及轉移是主要死亡原因，因此深入研究影響腫瘤侵襲及轉移的機制，尋求腫瘤的新靶點，對食管癌的治療及提高患者生存率有重大意義。EMT是一種以上皮細胞標志物如E-cadherin、細胞角蛋白等減弱或消失，間質細胞標志物如Vimentin、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等表達增加，同時MMP等表達上調，肌動蛋白細胞骨架重組，細胞間的黏附和極性丟失，干細胞樣特性出現等為特征的細胞表型轉化過程。大量研究表明，極性上皮細胞獲得具侵襲和轉移能力的間質細胞表型是腫瘤細胞的發生和轉移的重要機制。

圖5 Vimentin在正常食管黏膜中的表達(MaxVisionTM法,100×)

圖6 Vimentin在食管鱗狀細胞癌中的表達(MaxVisionTM法,100×)

圖7 MMP-9在正常食管黏膜中的表達(MaxVisionTM法,100×)

圖8 MMP-9在食管鱗狀細胞癌中的表達(MaxVisionTM法,100×)

Slug又稱Snail2，是一種具有鋅指結構的上皮—間質轉化轉錄因子，在多種組織中表達，包括胎盤，成人的心、肝、腎、胰和骨骼肌。主要作用與神經嵴細胞的發育以及中胚層來源的器官形成相關，表達在上皮細胞和未分化的間質細胞中，維持未分化表型[4]。Slug在調節多種惡性腫瘤發生EMT中發揮關鍵作用[5]。研究表明，Slug可通過下調E-cadherin的表達促進腫瘤細胞EMT的發生[6]。但在對胰腺癌的研究中，有報道認為Slug與E-cadherin的表達并不存在相關性[7]。本實驗結果顯示，從正常食管黏膜—鱗狀上皮不典型增生—食管鱗狀細胞癌轉變過程中，Slug的表達呈上升趨勢，在中、低分化鱗狀細胞癌中表達比高分化明顯增加。并且Slug的表達與Vimentin成正相關，與E-cadherin成負相關，此結果與Uchikado等[8]報道一致。Slug基因可通過抑制E-cadherin的表達，促進間葉細胞標記Vimentin表達，誘導食管癌細胞EMT的發生，進而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。

表1 Slug 、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鱗狀細胞癌、食管鱗狀上皮不典型增生及正常食管黏膜中的表達 例(%)

表2 Slug 、E-cadherin、Vimentin及MMP-9在食管鱗狀細胞癌中的表達相關性 例

MMPs是一族鋅肽酶超家族, 具有降解細胞外基質成分的能力, 是目前已知的唯一能降解膠原纖維的酶類。其以酶原形式分泌而成，激活后形成的Ⅳ型膠原酶通過降解、破壞表面基底膜中的膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白促進腫瘤的侵襲轉移過程[9]。研究發現,MMP-3、MMP-7、MMP-9和MMP-13能誘導細胞發生EMT，使細胞獲得更強的侵襲性[10]。Joseph等[11]研究表明，Slug可增強MMP-9的表達，進而促進口腔鱗狀細胞癌的進展。Zhang等[7]對胰腺癌的相關研究顯示，Slug可通過顯著上調MMP-9的表達及肌動蛋白骨架的重組促進胰腺癌細胞的侵襲和轉移 。本實驗結果表明，隨著食管癌惡性程度的增高，MMP-9表達增加，其特點是胞質內有棕黃色顆粒,胞核不著色,表達陽性的腫瘤細胞多位于浸潤前沿。MMP-9作為細胞外基質降解過程中必不可少的酶，其大量分泌破壞細胞外基質結構，為腫瘤細胞向外侵襲開辟了道路。本研究還顯示，MMP-9的表達與Slug表達呈正相關,Slug可能通過增強MMP-9的表達，促進食管癌的侵襲和轉移。

綜上所述，Slug 轉錄因子通過誘導食管癌細胞EMT的發生及上調MMP-9的表達，在食管癌的發生發展以及癌細胞的浸潤和繼發轉移中發揮重要作用，因而推測其可能成為食管癌治療的新靶點。

]

[1] Lopez-Novoa JM,Nieto MA. Inflammation and EMT: an alliance towards organ fibrosis and cancer progression[J]. EMBO Mol Med,2009,1(6/7):303-314

[2] 何春年,張鴻瑞,徐翠清,等. 子宮頸上皮內瘤變和子宮頸鱗癌中Twist基因蛋白及Skp2表達[J]. 臨床與實驗病理學雜志,2011,27(5):468-472

[3] Wang X,Zhang K,Sun L,et al. Short interfering RNA directed against Slug blocks tumor growth, metastasis formation, and vascular leakage in bladder cancer[J]. Med Oncol,2010,29:119

[4] Savagner P. Laving the neighbor rhood: molecular mechanisms involved during epithelial-mesenchymal transition[J]. Bioessays,2001,23(10):912-923

[5] Kudo-Saito C,Shirako H,Takeuchi T,et al. Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells[J]. Cancer Cell,2009,15:195-206

[6] Tanaka Y,Terai Y,Kawaguchi H,et al. Prognostic impact of EMT(epithelial-mesenchymal-transition)-related protein expression in endometrial cancer[J]. Cancer Biol Ther,2013,14:13-19

[7] Zhang K,Chen D,Jiao X,et al. Slug enhances invasion ability of pancreatic cancer cells through upregulation of matrix metalloproteinase-9 and actin cytoskeleton remodeling[J]. Lab Invest,2011,91:426-438

[8] Uchikado Y,Natsugoe S,Okumura H,et al. Slug expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res,2005,11:1174-1180

[9] Karahan N,Guney M,Baspinar S,et al. Expression of gelatinase (MMP-2 and MMP-9) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in endometrial carcinoma[J]. Eur J Gynaecol Oncol,2007,28(3):184-188

[10] Cowden Dahl KD,Symowicz J,Ning Y,et al. Matrix metalloproteinase 9 is a mediator of epidermal growth factor-dependent e-cadherin loss in ovarian carcinoma cells[J]. Cancer Res,2008,68(12):4606-4613

[11] Joseph MJ,Dangi-Garimella S,Shields MA,et al. Slug is a downstream mediator of transforming growth factor-beta1-induced matrix metalloproteinase-9 expression and invasion of oral cancer cells[J]. J Cell Biochem，2009，108(3):726-736

esophageal squamous cell carcinoma

JIANG Linna, LU Sanjun, GUI Hongwu, WEI Ping, YANG Xueli, YIN Feng

(The Fisrt Hospital of Handan City, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to observe the expression of Slug, E-cadherin, Vimentin and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinomas, and evaluate the mechanism of Slug in the invasion and metastases of esophageal squamous cell carcinomas. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of Slug, E-cadherin, Vimentin and MMP-9 in 70 cases of esophageal squamous cell carcinoma tissue, 17 cases of squamous atypical hyperplasia tissue and 20 cases of normal esophageal mucosa tissue. Results The protein levels of Slug, Vimentin and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma were showed higher expression, and they were significantly higher than that in normal esophageal mucosa tissue (allP<0.05), and the expressions increased with the malignant degree. The expression of E-cadherin was decreased in esophageal cancer tissues (P<0.05). The level of MMP-9 expression of Slug was positively correlated with Vimentin and MMP-9 in esophageal cancer tissue (allP<0.05), and was negative correction with E-cadherin (P<0.05). Conclusion Slug plays a important role in the process of invasion and metastasis by induce epithelial-mesenchymal transition and up-regulating the expression of MMP-9 in esophageal cancer.

esophageal squamous cell carcinomas; Slug; MMP-9; epithelial-mesenchymal transition; Vimentin

姜琳娜，女，主治醫師，碩士研究生，研究方向為食管癌。

路三軍，E-mail：lusanjun211@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.006

R735.2

A

1008-8849(2015)06-0586-04

2014-09-10