桂枝湯及其體外消化道模擬產(chǎn)物對(duì)于小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株分泌功能的影響

李 冠

(湖北省襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021)

桂枝湯及其體外消化道模擬產(chǎn)物對(duì)于小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株分泌功能的影響

李 冠

(湖北省襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021)

目的 觀察桂枝湯及其體外消化道模擬產(chǎn)物對(duì)于白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)介導(dǎo)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3分泌功能的影響。方法 選取小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3細(xì)胞，分為正常組,對(duì)照組，5%,10%和20%桂枝湯含藥血清組及5%,10%和20%模擬藥組。比較各組前列腺素E2(PGE2)、前列腺素(PGES)、分泌型磷脂酶A2(sPLA2)、15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)和胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)表達(dá)水平。結(jié)果 在不同濃度桂枝湯含藥血清和模擬藥組中，PGE2、PGES、sPLA2及15-PGDH和cPLA2含量均隨著血清含藥濃度升高而逐漸下降且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；桂枝湯含藥血清和模擬藥相同藥物濃度組中，各指標(biāo)含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 桂枝湯及其體外消化道模擬產(chǎn)物對(duì)于IL-1β介導(dǎo)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3 細(xì)胞分泌功能具有相似效果，可為模擬產(chǎn)物應(yīng)用開發(fā)提供支持。

桂枝湯；體外消化道模擬產(chǎn)物；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

Influence of Guizhi Decoction and its in vitro gastrointestinal simulation products on the secretory

桂枝湯是常用的治療外感風(fēng)寒表虛證的中藥，具有解肌發(fā)表、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的作用，主要由桂枝、芍藥、甘草、生姜、大棗組成[1]。桂枝湯以湯藥的形式口服，制備過程簡(jiǎn)單粗放，單次服用劑量較大；且由于服藥對(duì)象個(gè)體的差異，同一方劑用于不同患者的效果不同；另外胃腸道的消化及吸收可能會(huì)影響藥物的效果。有研究報(bào)道,中藥方劑中真正的藥物分子或前體即效應(yīng)分子應(yīng)是存在于通過消化道吸收后進(jìn)入血液循環(huán)前，即進(jìn)入門靜脈的一瞬間的那些物質(zhì)之中,它們才是中藥方劑整體效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)或方劑的效應(yīng)物質(zhì)[2]。因此建立一套以純化中藥、提高藥效、改變傳統(tǒng)給藥方式為主要目的的集成方法，制備中藥的消化道模擬產(chǎn)物(模擬藥)用以研究中藥的藥效是一種有效的方法。本研究模擬消化道的原理建立了中藥分離純化體系，制備了桂枝湯的模擬藥，并觀察了中藥桂枝湯與其模擬藥對(duì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)介導(dǎo)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(bEnd.3)細(xì)胞分泌功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1藥材 桂枝湯組方：桂枝10 g、生姜10 g、大棗10 g、甘草7 g、芍藥10 g，藥材購(gòu)于本院藥房。

1.1.2細(xì)胞 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3購(gòu)自上海瑞鹿生物科技有限公司。

1.1.3試劑 胎牛血清、胰蛋白酶、菌酶和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海川翔生物科技有限公司；前列腺素E2(PGE2)、前列腺素(PGES)、分泌型磷脂酶A2(sPLA2)、15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)和胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，IL-1β購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4儀器 Power Pac Basic電泳儀、SORVALL低溫離心機(jī)、JY96-Ⅱ型超聲細(xì)胞粉碎儀、CliniBio 128D 型酶標(biāo)儀均購(gòu)自寧波新芝電器公司，HW-8B型超級(jí)微量恒溫器購(gòu)自上海浦口分析儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1桂枝湯的制備 將桂枝10 g、生姜10 g、大棗10 g、甘草7 g、芍藥10 g浸泡于8倍劑量的水中1 h，煎煮30 min，濾取藥液，然后在殘余的藥渣內(nèi)加6倍的水，再煎煮30 min，過濾，合并2次濾液，以蒸餾水調(diào)至適當(dāng)濃度。

1.2.2桂枝湯消化道模擬產(chǎn)物的制備 將20 mL桂枝湯湯劑加入100 mL蛋白質(zhì)濃度為1 300 mg/mL菌酶溶液中，充入氮?dú)猓?2 ℃培養(yǎng)36 h，7 000 r/min離心15 min，取上清，經(jīng)過膜孔徑50萬Da的超濾柱純化,收集超濾液,減壓濃縮至1.0 g飲片/mL[3]。

1.2.3分組及細(xì)胞培養(yǎng) 選取小鼠bEnd.3細(xì)胞株，分為正

常組、5%,10%和20%桂枝湯含藥血清組及5%,10%和20%模擬藥組。使用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2、95%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)bEnd.3細(xì)胞株，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合，將細(xì)胞消化成2×109L-1濃度后，以每孔0.5 mL接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，用無血清DMEM液培養(yǎng)24 h后傾出。其中正常組采用20 mL正常鼠血清+80 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。5%,10%和20%桂枝湯含藥血清組分別用相應(yīng)濃度的桂枝湯含藥血清20 mL+80 mL培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。5%,10%和20%模擬藥組分別用相應(yīng)濃度的模擬藥含藥血清20 mL+80 mL培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。每組設(shè)20個(gè)平行孔，孵育36 h后，除正常組外，均加入終濃度30 mg/L的IL-1β刺激細(xì)胞10 h。

1.2.4檢測(cè)指標(biāo)及方法 吸取各組細(xì)胞，外液采取ELISA法測(cè)定PGE2、PGES、sPLA2、15-PGDH和cPLA2水平。同時(shí)在450 nm波長(zhǎng)處，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度。

2 結(jié) 果

在桂枝湯含藥血清和模擬藥各組中，PGE2、PGES、sPLA2及15-PGDH和cPLA2含量均隨著血清濃度升高而逐漸下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；桂枝湯含藥血清和模擬藥相同藥物濃度各組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組PGE2、PGES、sPLA2及15-PGDH、cPLA2含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與5%桂枝湯含藥血清組比較，P<0.05；③與10%桂枝湯含藥血清組比較，P<0.05；④與5%模擬藥組比較，P<0.05；⑤與10%模擬組比較，P<0.05。

3 討 論

傳統(tǒng)中藥多以湯藥形式口服給藥，其在體內(nèi)發(fā)揮治病作用需要經(jīng)過消化道、腸道菌群的作用，生成一種由中藥固有成分及其代謝產(chǎn)物組成的混合物，由胃腸道吸收入血在肝臟發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，隨血液循環(huán)至全身各個(gè)靶器官、組織，從而發(fā)揮藥理作用。因此中藥的有效成分是經(jīng)過復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的真正效應(yīng)物質(zhì)，其藥效與胃腸道吸收、排泄及吸收后體內(nèi)轉(zhuǎn)化有關(guān)。從整體效應(yīng)、活性成分、多組分整合角度對(duì)中藥進(jìn)行研究是中藥研究的方向。對(duì)于復(fù)方中藥藥效的研究經(jīng)歷了幾個(gè)階段，最開始將中藥直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，其缺點(diǎn)為：①體外實(shí)驗(yàn)藥物濃度與血藥濃度相差較大；②藥物滲透壓的影響；③藥物在體內(nèi)可以刺激體內(nèi)神經(jīng)體液系統(tǒng)分泌有利于人體的物質(zhì)；④藥物無法經(jīng)過胃腸道的轉(zhuǎn)化，其作用不能代表全部中藥的作用。后來采用血清藥理實(shí)驗(yàn)方法研究中藥的作用，利于從細(xì)胞及分子水平上探討中藥的作用機(jī)制,但不能完全代替整體實(shí)驗(yàn)，中藥對(duì)消化道的直接作用等也難以在血清中體現(xiàn)；只能顯示某一個(gè)或某幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)藥物的作用，不能反映藥物的整體作用。最近有研究顯示，給大鼠口服桂枝湯后，藥物成分在大鼠的胃、十二指腸中沒有明顯的變化，在腸道下端轉(zhuǎn)化明顯，可能與腸道菌群有關(guān)[4]，該研究針對(duì)桂枝湯在大鼠胃腸道內(nèi)的消化、吸收特點(diǎn)，使用HPLC指紋圖譜，對(duì)桂枝湯經(jīng)過胃腸道的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了模擬分析，顯示經(jīng)過腸道轉(zhuǎn)化后

藥物中的肉桂酸、甘草苷、甘草酸均消失,芍藥苷的含量也相對(duì)降低，同時(shí)生成新的化合物，稱之為模擬產(chǎn)物。本研究探討了桂枝湯及其模擬藥對(duì)IL-1β介導(dǎo)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3細(xì)胞分泌功能的影響。

前列腺素類是機(jī)體體溫調(diào)節(jié)的終端中樞遞質(zhì)，PGE2與發(fā)熱密切相關(guān)[4]，而15-PGDH幾乎是前列腺素類所有生物轉(zhuǎn)化途徑的起動(dòng)環(huán)節(jié)[5]。環(huán)氧合酶(COX)是合成PGE2的關(guān)鍵酶，COX分為COX-2和COX-1，PGE2在炎癥或發(fā)熱過程中主要由COX-2合成，PGE2合成后數(shù)分鐘內(nèi)瞬時(shí)釋放與COX-1有關(guān)，其表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，主要是維持正常的生理功能；PGE2合成后數(shù)小時(shí)延遲釋放與COX-2有關(guān)，在細(xì)胞受到刺激時(shí)迅速合成，參與多種病理生理過程，是發(fā)熱反應(yīng)涉及的信號(hào)通路[6]。

PLA2是一類能催化磷脂甘油分子二位(Sn2)酞基水解的酶類,是炎癥、內(nèi)毒素?fù)p傷細(xì)胞功能的關(guān)鍵酶[7],炎癥遞質(zhì)作用于單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞,使PLA2活化并且促進(jìn)前列腺素和白三烯等炎癥遞質(zhì)的合成[8]。PLA2主要有sPLA2和cPLA2兩種形式，其中sPLA2與炎癥的發(fā)生較為密切， 可以通過激活sPLA2-COX-2信號(hào)通路，引起PGE的釋放，從而引起發(fā)熱反應(yīng)[9]。小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是介于血液循環(huán)與組織之間的屏障，是血腦屏障的組成部分，其在內(nèi)生致熱源IL-1、TNF等刺激下可以導(dǎo)致中樞性致熱物質(zhì)的產(chǎn)生，如PGE2、PGES、sPLA2、15-PGDH和cPLA2等升高[10]，因此在本研究中使用IL-1β刺激小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3細(xì)胞制備發(fā)熱的體外模型。結(jié)果顯示IL-1β刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的PGE2、PGES、sPLA2、15-PGDH和cPLA2等均較正常細(xì)胞升高，與IL-1β刺激小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3細(xì)胞后COX-2活化程度升高有關(guān)，提示發(fā)熱模型制備成功。然后分別用5%，10%和20%桂枝湯含藥血清及5%，10%，20%的模擬藥的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示PGE2、PGEs、sPLA2、15-PGDH和cPLA2含量隨著桂枝湯含藥血清及模擬藥濃度升高而逐漸下降，兩者的效果相當(dāng)，提示模擬藥是桂枝湯的有效作用成分，對(duì)于IL-1β引起的炎癥反應(yīng)具有相同的藥效。桂枝湯及其模擬藥可能是通過降低PLA2的量和活性，降低COX-2的活性而減少PGE2的生成，對(duì)抗發(fā)熱反應(yīng)。

綜上所述，桂枝湯和其消化道模擬產(chǎn)物具有相同的臨床效用，均可以通過降低PLA2及COX-2的活性，減少PEG2的分泌和產(chǎn)生，對(duì)抗發(fā)熱反應(yīng)，這為體外模擬產(chǎn)物直接進(jìn)行藥效試驗(yàn)研究提供了有力證據(jù)，該方法對(duì)改進(jìn)中藥的復(fù)方劑型，降低胃腸道對(duì)中藥藥效的影響，提高臨床治療效果，減少不良反應(yīng)提供了依據(jù)。

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function of mouse brain microvascular endothelial cell line

LI Guan

(The Central Hospital of Xiangyang City, Xiangyang 441021, Hubei, China)

Objective It is to observe the influence of Guizhi Decoction and its in vitro gastrointestinal simulation products for interleukin-1β (IL-1β) on the secretion function of mouse brain microvascular endothelial cell line (bEnd.3). Methods The mice bEnd.3 cell lines were divided into 8 groups: normal control group, 5%, 10% and 20% of Guizhi Decoction drug serum group and 5%, 10% and 20% analog medicine group. The expression of prostaglandin E2(PGE2), prostaglandin (PGES), secretory phospholipase A2(sPLA2), 15- hydroxy prostaglandin dehydrogenase (15-PGDH) and cytosolic phospholipase A2((cPLA2) were compared. Results In groups of Guizhi Decoction medicated serum and mimetics, the levels of PGE2, PGES, sPLA2, 15-PGDH and cPLA2were increased with the decrease of medicated serum concentration (allP<0.05); there was no significant difference in various index between the same concentration groups of Guizhi Decoction serum and simulation drug serum (allP>0.05). Conclusion Guizhi decoction and its in vitro gastrointestinal simulation products have similar affect on the secretory function of mouse bEnd.3 cell line mediated byIL-1β, so that can provide the support for the simulation of product application development.

Guizhi Decoction; in vitro gastrointestinal simulation products; brain microvascular endothelial cells

李冠，男，主管藥師，主要研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.06.008

R965

A

1008-8849(2015)06-0593-03

2014-09-08