肌原纖維蛋白轉谷氨酰胺酶交聯程度對魚糜凝膠及其風味釋放影響的研究進展

安玥琦，熊善柏*

（華中農業大學食品科學技術學院，國家大宗淡水魚加工技術研發分中心，湖北 武漢 430070）

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肌原纖維蛋白轉谷氨酰胺酶交聯程度對魚糜凝膠及其風味釋放影響的研究進展

安玥琦，熊善柏*

（華中農業大學食品科學技術學院，國家大宗淡水魚加工技術研發分中心，湖北 武漢 430070）

摘 要：轉谷氨酰胺酶可以催化肌原纖維蛋白發生交聯反應。隨著交聯程度的增加，魚糜凝膠從彈黏體變為彈脆體，風味也隨之改變。風味物質的擴散、釋放與凝膠網絡的交聯程度密切相關，因此深入了解交聯程度與食品品質的關系及風味物質在凝膠網絡中的擴散行為顯得尤為重要。本文總結轉谷氨酰胺酶催化肌原纖維蛋白的交聯機理，歸納了國內外對肌原纖維蛋白交聯程郭彩霞度的測定方法與影響因素，探討交聯程度對魚糜蛋白的凝膠特性與風味釋放的影響，并對今后的研究方向提出思考與展望。

關鍵詞：轉谷氨酰胺酶；肌原纖維蛋白；交聯程度；檢測方法；魚糜凝膠；影響因素

肌原纖維蛋白是魚糜肌肉中的主要蛋白質[1]，在加熱條件下肌原纖維蛋白發生凝膠化，使魚糜蛋白表現出液體黏性和固體彈性兩種形態之間的性質[2]，從溶膠狀態變成高黏彈性的凝膠網絡結構。轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase，EC.2.3.2.13）能催化蛋白質上賴氨酸的ε-氨基與谷氨酸的γ-羥酰氨基形成共價鍵，促進蛋白質分子間或分子內的共價交聯，增強凝膠網絡結構的形成[3]。

近年來，隨著微生物轉谷氨酰胺酶的高效生產，TGase被廣泛運用于食品加工中[4]。目前的研究發現，在肌原纖維蛋白加熱形成凝膠的過程中，轉谷氨酰胺酶的添加不僅可以增強凝膠的交聯程度，當超過一定添加量或低溫凝膠化時間較長時，魚糜凝膠將由彈黏體向彈脆體發生躍變[5]，同時魚鮮味也隨之變弱甚至喪失，一些口感脆爽的傳統食品（如捶魚、捶肉等）也存在這種現象，該風味的變化是因其凝膠網絡結構的變化所導致還是與其他因素有關尚未見報道。已有研究發現NaCl在草魚肌肉中的擴散性能與肌纖維的方向有關[6]，可見風味等小分子物質在蛋白凝膠網絡結構中的行為特性與蛋白的空間結構有密切的關系，凝膠網絡結構會影響到魚糜蛋白的嫩度、多汁性和風味釋放等特性[7]。在魚糜凝膠中加入TGase發生交聯后所形成的凝膠網絡結構，對魚糜凝膠的口感與風味具有影響。因此掌握交聯程度的測定方法與影響因素，以便深入了解交聯程度對魚糜凝膠的影響及物質擴散與凝膠網絡的關系，并合理控制其交聯程度顯得尤為重要。

1　肌原纖維蛋白的TGase交聯機制

1.1肌原纖維蛋白的膠凝過程

肌原纖維蛋白的熱誘導凝膠性能是魚糜制品加工的基礎。熱作用使蛋白質發生變性，使被包埋的活性基團暴露而產生分子間相互作用，當排斥力和吸引力達到平衡便聚集形成凝膠網絡結構[8]。膠凝過程中，肌原纖維蛋白在NaCl作用下發生溶出、α-螺旋解旋、松弛，隨著溫度的上升，肌球蛋白頭部的S1片段在35 ℃時展開，通過頭部之間的相互作用形成二聚體和寡聚體，隨著溫度升高至40～45 ℃時，球狀頭部的聚集體連接形成低聚體，在55 ℃以上，低聚體進一步聚集，通過尾部之間的交聯，形成顆粒體，即組成凝膠網狀結構的基本骨架[9]。肌原纖維蛋白的膠凝過程主要經歷蛋白質的變性與聚集兩個歷程[8]。變性與聚集的相對速率決定了凝膠的結構與特性，當變性速率大于聚集速率時，蛋白質分子能充分伸展、相互作用而形成高度有序的半透明凝膠體；然而，當變性速率低于聚集速率時，形成的凝膠體較粗糙、不透明，且彈性較差[10]。蛋白質分子構象的變化是其聚集的先決條件[11-12]，加熱時肌球蛋白α-螺旋的展開及β-折疊的形成在肌肉蛋白質膠凝過程中起著非常重要的作用[13-14]，然而，如果加熱前蛋白質的有序二級結構轉變成較多的隨機卷曲，其凝膠形成能力也隨之降低[15]。

1.2TGase的交聯機制

轉谷氨酰胺酶是一種轉酰胺酶，在催化反應中，肽鏈上谷氨酰殘基的γ-酰氨基是酰基供體，而酰基受體可以是賴氨酸的ε-氨基、伯胺和水[4]。其相應的反應機理如圖1所示。

圖1　轉谷氨酰胺酶的催化交聯反應機制Fig.1 Cross-linking reactions catalyzed by transglutaminase

當酰基受體為賴氨酸的ε-氨基時，發生交聯反應，產生[ε-（γ-glutamyl）lysine]共價鍵。由于肌原纖維蛋白中含有較多的賴氨酸，因此TGase的作用主要是發生交聯反應，使肽鏈谷氨酰胺與肽鏈上賴氨酸殘基的N端相連，形成分子內及分子間的網狀結構，從而增強魚糜的凝膠性能[3]。

2　肌原纖維蛋白TGase交聯程度的測定與影響因素

2.1TGase交聯程度的測定方法

在肌原纖維蛋白的結構中，蛋白-蛋白之間的交聯或者蛋白-水之間的相互作用，都會使肌原纖維蛋白性質發生改變。TGase的交聯反應增強了蛋白分子內或分子間的交聯，其交聯程度反映了凝膠網絡結構的致密性，決定了對蛋白質的凝膠特性與感官特性的影響程度[16]。綜合國內外目前的研究進展，表1歸納了TGase交聯程度的測定方法。

表1　轉谷氨酰胺酶交聯蛋白程度的測定方法Table 1 A sumay of methods used to test protein cross-linking catalyzed by transglutaminase

利用高效液相色譜法測定的[ε-（γ-Glu）Lys]共價鍵含量與魚糜的凝膠強度呈現出明顯的相關性[23]，是反映TGase交聯程度最準確的方法。在馬鮫魚干制的過程中加入微生物轉谷氨酰胺酶（microbial transglutaminas，MTGase），能觀察到肌動球蛋白重鏈的水解，在20 h 后[ε-（γ-Glu）Lys]共價鍵的含量增加了8 倍[24]。但是這種方法操作繁瑣、耗時長，在國內目前的研究中比較少見。相比而言，利用自由氨基與TNBS比色的方法則快速簡單，結果也相對準確。而通過氨氣的檢測則很難區分交聯反應、酰基轉移反應和脫氨反應，并且由于蛋白黏度和凝膠網絡的形成，阻礙了氨氣的釋放，導致結果有較大的誤差。目前國內外最常用的方法是SDS-PAGE，該方法可以簡單、直觀地觀察到MHC的水解，并且β-巰基乙醇不會水解還原由TGase催化的交聯產物[25]，使用適當的分離膠和濃縮膠還可以觀察到遠大于200 kD的交聯帶的形成[21,26]。此外，TGase的加入會顯著降低肌原纖維蛋白熱誘導凝膠的自旋-自旋弛豫時間（T2），可以通過低場核磁共振進行檢測[27]。肌原纖維蛋白經TGase交聯后的內部結構明顯變得致密、均勻，可以通過掃描電鏡、透射電鏡、原子力顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等方法進行觀察膠凝后的內部結構。這種方法雖然直觀，但是不能精確反映出交聯程度，也無法區分凝膠網絡中的二硫共價鍵與非二硫共價鍵[28-30]。

2.2交聯程度的影響因素

TGase催化肌原纖維蛋白的交聯反應受很多因素的影響，比如分子間作用力、蛋白結構與底物含量、酶添加量、溫度、pH值、反應時間、金屬離子等。

2.2.1 分子間作用力

肌原纖維蛋白中的分子間作用力對凝膠的交聯和穩定非常重要。對于魚肉蛋白質而言，TGase的作用溫度通常在40 ℃，這時主要形成的是[ε-（γ-Glu）Lys]等非二硫共價鍵，促進蛋白的交聯程度，而二硫鍵主要形成于40 ℃以上的溫度[31-33]，雖然二硫鍵不是凝膠網絡形成的必需條件，但可以提高肌肉蛋白質的凝膠強度[34]。維持魚糜凝膠交聯網絡結構的主要作用力除二硫鍵之外，還有疏水相互作用和非二硫共價鍵[34-35]。

2.2.2 蛋白結構與TGase底物含量

蛋白質的一級結構和構象影響著交聯程度，對于本身就含有大量而且充分暴露的谷氨酰胺和賴氨酸殘基的肌原纖維蛋白，TGase的添加會更易于發生交聯反應[36-37]，這可能也是大部分海魚都比淡水魚魚糜凝膠強度大的原因。另一方面，增加體系中谷氨酰胺和賴氨酸殘基的含量也可以增強魚糜蛋白的凝膠特性，比如添加其他肌肉蛋白、酪蛋白和明膠等[38]。但是對于本身交聯程度就很大的海水魚，外源蛋白的加入很可能會使魚糜的凝膠強度降低，如在金線魚魚糜中添加5%～20%魚類明膠，反而會使其凝膠強度下降，減弱TGase的交聯作用[39]。一些剛性結構蛋白因為它們缺乏可利用的谷氨酰胺和賴氨酸殘基會影響TGase誘導魚糜蛋白的交聯，如加入雞蛋清蛋白（egg albumin，EA）顯著降低MTGase誘導魚糜凝膠的凝膠強度和破斷強度，但不阻礙MTGase對肌球蛋白重鏈的交聯[40]。水解的小麥面筋蛋白會因干擾肌原纖維蛋白的加熱聚集從而阻礙肌原纖維蛋白交聯網絡結構的形成[41]。

2.2.3 TGase添加量

大部分學者的研究表明，MTGase的最適添加量一般在0.1%～0.5%左右[17,30]。當MTGase添加量過多時會降低魚糜的凝膠特性，如MTGase添加量為0.3 U/g魚糜時，Golden threadfin bream魚糜凝膠強度和凹陷深度達到最大值，增加MTGase用量，其凝膠強度下降[42]。這是由于交聯程度增加導致的，過多MTGase的添加使魚糜蛋白過度交聯從而導致魚糜凝膠特性的減弱。TGase的添加量也與蛋白種類有關，在牛肉凝膠中，添加0.3% TGase在50 ℃保溫后牛肉的加工特性最好[43]。

2.2.4 pH值、溫度與時間

MTGase的反應溫度范圍為4～65 ℃，最適溫度在40～50 ℃，最適pH值為5.0～8.0，根據肌原纖維蛋白種類的不同會略有差異，一般在肉制品中作用10 min就可以促進交聯，顯著影響制品的凝膠特性[44]。在魚糜制品中，長時間的低溫凝膠化，或是在40 ℃短時間保溫都可以使TGase的交聯效果顯著增強[45]。

2.2.5 金屬離子

內源性轉谷氨酰胺酶需要Ca2+激活，而微生物來源的MTGase不依賴Ca2+。低質量摩爾濃度Ca2+（10、20 mmol/kg）可激活鰱魚的FTGase催化肌球蛋白重鏈發生共價交聯，從而增加魚糜凝膠的凝膠強度和彈性，而較高的Ca2+質量摩爾濃度（50 mmol/kg）則會抑制肌球蛋白重鏈間的交聯，致使魚糜凝膠性能降低；當Ca2+質量摩爾濃度達到80 mmol/kg時，Ca2+與魚糜蛋白之間會形成鈣橋，導致魚糜凝膠變硬，彈性降低[42]。肌肉蛋白酶因誘導肌球蛋白迅速嚴重的降解而降低魚糜的凝膠強度，通常認為魚糜凝膠劣化與內源性熱穩定蛋白酶具有高度相關性[46]。還有研究表明Zn2+對TGase的交聯具有很強的抑制作用，可能是因為Zn2+會束縛半胱氨酸殘基的活性中心[47]。

3　交聯程度對魚糜凝膠的影響

3.1交聯程度對魚糜凝膠特性的影響

TGase催化肌原纖維蛋白發生交聯反應后，其蛋白的凝膠特性會發生明顯變化。在鳙魚魚糜中加入0.1%的TGase（101 U/100 g魚糜），就可以使其凝膠的破斷強度增加1 倍，隨著TGase添加量的增加，交聯程度進一步增強，其破斷強度和凹陷深度呈現先增加后下降的趨勢，破斷強度在TGase添加量1%時達到最大值，凹陷深度則在0.5%時最大[30]。這表明過多的交聯使魚糜凝膠的彈性減弱而變得硬而脆，由黏彈體向彈脆體發生躍變，這種躍變與TGase的交聯作用有關。用質構儀可以測定出魚糜凝膠的質構性能指標，在魚丸中添加0.3%的TGase，于40 ℃恒溫30 min后，其質構特性（彈性、回復性、硬度、脆性、咀嚼性、黏性等）達到較理想的效果，其中脆性指標由0.289躍變到0.381[48]。

這種魚糜凝膠特性隨著TGase交聯程度的增大而先增后減的躍變趨勢也體現在凝膠持水性中。研究表明，TGase添加量在0～0.6 U/g魚糜蛋白的范圍內，隨著TGase交聯程度的提高，魚糜肌原纖維蛋白分子鏈之間發生交聯，相互聚合而形成更致密、均勻的三維立體網狀結構凝膠體，這種內部致密的凝膠網絡結構的形成有助于束縛住其中的水分，從而促進其凝膠持水性的提高[39]。然而，當TGase的添加量超過0.6 U/g魚糜蛋白后，TGase交聯形成的過度緊密網絡結構會驅趕走其內部的其他物質，表現為凝膠持水性的下降，可能原因是[ε-（γ-Glu）Lys]共價鍵的增多影響到其他化學鍵的相互作用[49]。

3.2交聯程度對風味物質在凝膠中釋放的影響

水產品的風味物質包括滋味和氣味兩部分[50]。魚糜制品的滋味成分包括含氮化合物（游離氨基酸、有機堿、核苷酸、分子質量相對較小的肽類等）和不含氮化合物（有機酸、糖和無機鹽等）兩大類[51]；而魚肉的氣味主要是由于揮發性羰基化合物和醇類物質造成的，而這些化合物是通過特定的脂肪氧合酶作用于魚脂質中的多不飽和脂肪酸衍生而來的[52]。

感官鑒評時要求鑒評人員將食物在口腔中細細咀嚼品味一定時間后再吞下，主要目的是使食物中的風味成分充分釋放，同時其質地性能也可以感知，這都說明風味的釋放需要一個過程。風味的釋放實質上是風味物質在凝膠網絡中的擴散過程，該擴散與網絡結構的性質以及風味物質與凝膠網絡之間的相互作用密切相關。目前關于風味物質在凝膠網絡結構中釋放規律的研究不多，但已有研究表明，凝膠結構及其分離特征的改變會影響人們對風味的感知[53]。氨是TGase交聯蛋白過程中的主要揮發性成分，它影響著交聯食品的風味，但是單純在牛奶中加入TGase并沒有對其風味起到明顯的改善作用，而在高靜壓技術（high hydrostatic pressure，HHP）滅菌后，其風味有明顯差異，這可能是TGase與HHP的協同作用導致了一些活性位點的暴露[54]。除了氨的釋放，TGase在牛奶的交聯過程中并沒有顯著改變風味化合物的組成和含量，這可能與牛奶中的蛋白質并沒有形成較致密的凝膠網絡結構有關[55]。

還有研究發現，在蛋白中添加食用膠后，各類揮發性風味化合物含量均略有改善，可能是凝膠作用形成的交聯網絡最大限度地保留了蛋白質，促進了脂質氧化反應并抑制了風味化合物揮發[55]。并且，在TGase催化交聯后，其網絡結構可以在一定程度上減少游離氨基酸的損失，增加風味前體物的含量，使更多的風味前體物能夠在后期加工中轉化為風味成分，表現出更突出的特征風味[56]。

4　結 語

隨著消費者對食品營養與口感要求的增高與MTGase生產成本的降低，TGase在食品中的應用將不斷擴大。然而目前的研究大部分停留在TGase的添加量對凝膠特性的影響方面，對其催化的肌原纖維蛋白交聯機理與交聯程度的測定并不深入。因此進一步研究TGase對肌原纖維蛋白的交聯以及交聯后對食品口感、風味與消化吸收等特性的影響，以便合理控制TGase的交聯作用將具有重要意義。

今后的研究工作將集中在如下幾方面：1）研究促進肌原纖維蛋白交聯的機理與影響因素。已有研究發現通過一定的手段，比如改善蛋白質的結構、添加一定量的TGase、在適宜溫度下延長交聯反應時間等可以促進肌原纖維蛋白的交聯，可深入研究氨基酸組成與分布以及肌原纖維蛋白鏈的結構等因素對交聯程度的影響，合理選擇具有適當結構的蛋白以改善食品特性；2）探尋快速、準確交聯程度的檢測方法。肌原纖維蛋白的交聯程度很大程度上影響著產品的釋放，因此探尋有效的檢測TGase交聯程度的手段并合理控制其交聯十分必要。并可以監測脆性魚糜凝膠形成過程中凝膠網絡微結構的變化，采用蛋白質高級結構的變化、鍵力的形成、網絡節點和致密度等變化表征膠凝過程中結構演化規律；3）研究交聯網絡對風味釋放的影響。目前，食品中對風味物質的控釋主要通過微膠囊技術來實現，然而，風味的釋放與食品交聯網絡的內在聯系尚未見報道。可研究相應條件下魚糜凝膠形成過程中滋味和氣味物質的擴散動力學，剖析脆性魚糜凝膠中風味物質的遷移和釋放規律，探討控制脆性魚糜凝膠網絡結構的形成及風味釋放的關鍵因素，從凝膠網絡結構的角度來闡述魚糜凝膠風味的控釋機理。

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Effect of Transglutaminase-Catalyzed Cross-Linking Degree of Myofibrillar Protein on Surimi Gelation and Flavor Release

AN Yueqi, XIONG Shanbai*
(National Research and Development Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract:Transglutaminase catalyses the cross-linking of myofibrillar proteins. Textural properties of surimi gel can be transformed from elastico-viscous body to elastico-crisp body in response to an increase in cross-linking degree, accompanied by an obvious change in its flavor. The flavor diffusion and release are closely related to the degree of compactness and interactions of gel structure. So it is very meaningful to study the relationship between the cross-linking degree and texture properties of foods, and the diffusion behavior of flavor compounds in gel networks. In this paper, the mechanism of transglutaminase-catalyzed cross-linking of myofibrillar protein is summarized. Existing assay methods for the cross-linking of myofibrillar protein and its influencing factors are also reviewed. The effects of cross-linking degree on surimi gelation and flavor are discussed. Moreover, further research directions are proposed.

Key words:transglutaminase; myofibrillar proteins; cross-linking degree; assay methods; surimi gelation; influencing factors

中圖分類號：TS201.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0235-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507043

*通信作者：熊善柏（1963—），男，教授，碩士，研究方向為水產品加工及貯藏工程。E-mail：xiongsb@mail.hzau.edu.cn

作者簡介：安玥琦（1991—），女，碩士研究生，研究方向為水產品加工及貯藏工程。E-mail：ayq19911111@126.com

基金項目：國家現代農業（魚）產業技術體系建設專項（CARS-46-23）；國家自然科學基金面上項目（31371796）

收稿日期：2014-05-16