糖原合酶激酶-3β 抑制劑TWS119 對γδT 細胞增殖及表型的影響①

陳永強 鄭 璐 劉軍權 呂小婷 周 燏 陳 玲 徐 晶 周忠海 陳復興

(解放軍第97 醫院中心實驗室，徐州 221004)

4，6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)是糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制劑，目前研究發現TWS119 通過激活Wnt/β-catenin信號通路阻滯CD8+T 淋巴細胞的分化獲得表達CD45RA+CD62L+CCR7+CD95+的干細胞樣記憶細胞(Stem cells memory T cells，TSCM)和CD45RA+CD62L+的早期分化細胞，這群細胞在體內具有強增殖能力和抗腫瘤活性［1-3］。γδT 細胞是T 淋巴細胞中表達γδTCR 的一個亞群，約占外周血T 淋巴細胞的0.5%～5%，在機體的抗感染、抗腫瘤和免疫監視等方面起到重要作用［4］。體外常規擴增的γδT細胞已經用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效［5］。為了提高γδT 細胞治療效果，我們認為使回輸到體內的γδT 細胞能在體內較長時間的生存并能遷移到腫瘤部位，從而發揮有效的免疫監視和殺傷腫瘤的作用至關重要。因此，本研究觀察TWS119 調控Wnt/β-Catenin 信號通路對γδT 細胞增殖和表型的影響，以期獲得新型的γδT 細胞。

1 材料與方法

1.1 材料 TWS119 購自Sigma 公司，用二甲亞砜(DMSO)溶解配制母液為8 mmol/L，實驗時再用RPMI1640 培養液稀釋至各實驗濃度(各實驗組DMSO 終體積分數≤0.1%)，對照組中加入相同濃度的DMSO;RPMI1640 和小牛血清購自Gibco 公司;人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司;重組人白細胞介素-2(rhIL-2)，異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)購自廈門特寶生物工程股份有限公司;熒光抗體PerCPcy5.5-γδTCR、FITC-CD45RA 和PE-CD62L 和 流 式細胞儀均為美國Becton Dickson 公司產品;CCK-8試劑盒、BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、Western 及IP 細胞裂解液和PVDF 膜均購自碧云天生物技術研究所;人AB 型血清購自徐州市血站。

1.2 方法

1.2.1 γδT 細胞的培養 取健康獻血者外周抗凝血20 ml，加入淋巴細胞分離液，1 800 r/min 離心10 min，吸取人末梢血單個核細胞(PBMCs)層，用生理鹽水洗滌，1 800 r/min 離心15 min。然后將PBMCs加入含10%小牛血清、5% AB 血清、1 μg/ml 的異戊烯焦磷酸和200 U/ml 的rhIL-2 的γδT 培養基中，于37℃、5% CO2培養箱中培養，根據細胞生長情況及時添加培養基。

1.2.2 γδT 細胞鑒定 將培養10 d 的γδT 細胞在倒置顯微鏡下進行形態觀察，并用PerCP-cy5.5-γδTCR 抗體標記細胞用流式細胞儀進行表型檢測，試驗重復3 次。

1.2.3 TWS119 活化Wnt/β-catenin 信號通路中βcatenin 表達影響 取培養10 d 的γδT 細胞，調整細胞數為1 ×105ml-1的細胞懸液，接種于6 孔板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為(0.0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L)的TWS119，于37℃、50 ml/L CO2培養箱中培養72 h。收集細胞并用PBS 洗滌1 次后，用Western blot 及IP 細胞裂解液60 μl 充分裂解提取蛋白，BCA 法測樣品蛋白濃度后以10% SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉移到PVDF 膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，兔抗人β-catenin 和鼠抗人GAPDH 一抗(1∶500)4℃封閉過夜，堿性磷酸酶標記抗鼠二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。然后利用碧云天生物技術研究所生產的BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，按照操作手冊進行顯色。然后用數碼相機進行拍照記錄。試驗重復3 次。

1.2.4 CCK-8 法檢測TWS119 對γδT 細胞增殖的影響 取培養10 d 的γδT 細胞，調整細胞數至1.0 ×105ml，取180 μl 接種于96 孔板，加入終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L TWS119，每組設4 個復孔。培養48 h 后每孔加入20 μl 的CCK-8 液，繼續培養4 h 后于570 nm 處測定光密度值。

1.2.5 流式細胞儀檢測γδT 細胞上CD45RA 和CD62L 的表達 將培養成功的γδT 細胞配成濃度為1.0 ×105ml 的細胞懸液，接種于6 孔培養板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的TWS119。于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h。收集細胞并用PBS 洗滌2 次，每管分 別 加 入10 μl 的PerCP-cy5.5-γδTCR、FITCCD45RA 和PE-CD62L，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml 的PBS 溶液中，用流式細胞術檢測CD45RA 和CD62L 的表達。

1.3 統計學分析 采用SPSS16.0 軟件進行數據處理，數據以±s 表示，組間均值比較采用t 檢驗，P＜0.05，P＜0.01 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 γδT 細胞鑒定 從健康獻血者外周血中分離獲得單個核細胞后用γδT 細胞的培養液培養于37℃、5%CO2培養箱中培養，2 d 后γδT 細胞開始增殖，4 d 后呈集落式生長，到第8 天后出現許多大小不同的細胞集落，細胞成梭形(圖1A)。用流式細胞儀檢測細胞表型，結果如圖1B 顯示，γδT 細胞比率達(76.85 ±4.85)%。以上結果提示γδT 細胞培養成功，可為后續實驗使用。

圖1 γδT 細胞的鑒定Fig.1 Proportion of γδT cells

2.2 TWS119 對γδT 細胞中β-catenin 蛋白表達影響 Wnt 信號通路在細胞分化過程中起關鍵作用，該通路可以被TWS119 通過抑制GSK-3β 活性使βcatenin 在細胞內積聚而激活。將不同濃度TWS119培養的γδT 細胞經Western blot 檢測結果顯示，隨著TWS119 濃度增加，γδT 細胞內β-catenin 表達量逐漸增多，呈劑量依賴性，說明TWS119 可以激活γδT細胞中的Wnt/β-catenin 信號通路(圖2)。

2.3 TWS119 對培養γδT 細胞純度的影響 在γδT細胞培養過程中，分別于第1 天和第8 天時，加入不同濃度的TWS119 誘導培養。培養到12 d 時經流式細胞儀檢測結果顯示:第1 天加入TWS119 誘導培養組中，濃度在0.5～2.0 μmol/L 時對γδT 細胞純度影響不明顯，與對照組相比無統計學差異(P ＞0.05);濃度在4.0 和8.0 μmol/L 時，與對照組相比能顯著抑制γδT 細胞純度(P＜0.05，P＜0.01)。而在第8 天加入TWS119 誘導培養組中，在0.5～8.0 μmol/L 范圍內能顯著提高γδT 細胞純度(P＜0.05，P＜0.01)。見圖3。

2.4 TWS119 對γδT 細胞增殖影響 第1 天加入TWS119 誘導培養組中，經0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的TWS119 誘導培養12 d 后，CCK-8 法檢測結果顯示，TWS119 濃度在2.0 μmol/L 時能促進γδT細胞的增殖(P＜0.05);當濃度(＞2.0 μmol/L)時，顯著抑制γδT 細胞的增殖(P＜0.05，P＜0.01)。而在第8 天加入TWS119 進行誘導培養到12 d 后，各濃度組增殖率分別為:(29.35 ±5.95)%、(40.53 ±4.12)%、(81.38 ± 6.33)%、(70.37 ± 5.85)%、(-11.29 ±3.86)%。與0 μmol/L TWS119 對照組相比，0.5～4.0 μmol/L 組增殖率顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，2.0 μmol/L TWS119 處理的γδT 細胞增殖率達到最高值(81.38±6.33)%;當濃度增高到8.0 μmol/L 時，增殖率低于對照組(圖4)。

圖2 TWS119 對γδT 細胞中β-catenin 蛋白表達影響Fig.2 Western blot analysis of β-catenin expression in γδT cells

圖3 TWS119 對培養γδT 細胞純度的影響Fig.3 Ratios of induced γδT cells under different concentrations of TWS119

圖4 TWS119 對γδT 細胞增殖的影響Fig.4 Effect of treatment of TWS119 on γδT cell proliferative response

表1 TWS119 對γδT 細胞CD45RA 和CD62L 表達的影響Tab.1 Effect of TWS119 on expression of CD45RA and CD62L in γδT cells

圖5 TWS119 對γδT 細胞CD45RA 和CD62L 表達的影響Fig.5 Effect of TWS119 on expression of CD45RA and CD62L in γδT cells

2.5 TWS119 對γδT 細胞表型的影響 經不同時間加入不同TWS119 誘導培養到12 d 后，經流式細胞儀檢測結果顯示，不同加入時間和不同劑量對CD62L 和CD45RA 的表達有影響。如表1 和圖5 所示，濃度在0～8.0 μmol/L 范圍內TWS119 能促進γδT 細胞表面標志CD62L 的表達，且第1 天加入TWS119 誘導組CD62L 的表達要高于第8 天加入組。TWS119 對γδT 細胞表面標志CD45RA 表達的影響結果中顯示，僅在第1 天加入TWS119 誘導組中4.0 μmol/L 和8.0 μmol/L 濃度組能顯著提高CD45RA 的表達，而在第8 天時再加入TWS119 對CD45RA 的表達變化不明顯。

3 討論

Wnt/β-catenin 信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，在調控干細胞的自我更新、多潛能性和不同發育階段胸腺細胞的生長中起關鍵作用［6，7］。最近研究人員為了在體外獲得最佳分化狀態的免疫細胞應用以腫瘤過繼性免疫治療，發現用GSK-3β 抑制劑TWS119 活化T 淋巴細胞的Wnt/βcatenin 信號通路可以阻滯初始T 細胞向效應T 細胞分化，獲得CD45RA+CD62L+早期分化的細胞和TSCM［2，8，9］。而且TSCM 細胞具備干細胞的特性，具有很強的增殖和分化能力，體內腫瘤移植實驗表明其體內有很強的抑瘤活性，與其他效應細胞相比在體內生存期明顯延長［10，11］;用CD3/CD2/CD28 特異性抗體激活后與IL-7、IL-15 共培養，TSCM 細胞也能有效的擴增［12］。因此，我們在培養γδT 細胞時加入TWS119 進行誘導培養，首先觀察誘導前后γδT細胞的增殖和純度變化。結果發現，在培養γδT 細胞的第1 天加入TWS119 進行誘導培養到12 d 時，濃度在0.5～2.0 μmol/L 時對γδT 細胞的增殖和純度影響不明顯，當濃度大于2 μmol/L 時能顯著抑制γδT 細胞的增殖和純度;而在第8 天加入TWS119誘導培養到12 d 時，在0.5～4.0 μmol/L 范圍內能顯著促進γδT 細胞的增殖并能提高γδT 細胞的純度，當濃度大于8.0 μmol/L 時γδT 細胞增殖率和純度降低。TWS119 加入誘導時間的不同對增殖和純度的影響可能跟細胞的分化狀態有關。

根據T 細胞的表型和效應功能可以分為初始T細胞、干細胞樣中樞記憶T 細胞、中樞記憶T 細胞、效應記憶T 細胞和效應T 細胞［13，14］。CD45RA 表達于初始細胞和記憶性干細胞，而L-選擇素(CD62L)屬于黏附分子超家族，廣泛分布于初始T細胞記憶性干細胞和中樞型記憶T 淋巴細胞表面，是淋巴細胞的特異性歸巢受體，在介導初始淋巴細胞歸巢到外周淋巴結和淋巴細胞在炎癥和腫瘤部位中起著至關重要的作用［15］。TWS119 對γδT 細胞表型影響研究發現，經不同時間加入不同濃度的TWS119 誘導培養γδT 細胞到12 d 后，經流式細胞儀檢測結果顯示，濃度在0～8.0 μmol/L 范圍內，僅第1 天加入TWS119 誘導組中4.0 μmol/L 和8.0 μmol/L 濃度組能顯著提高CD45RA 的表達。而對CD62L 表達方面，TWS119 能促進γδT 細胞表面標志CD62L 的表達，且第1 天加入TWS119 誘導組CD62L 的表達要高于第8 天加入組。提示用TWS119 誘導培養γδT 細胞可以阻滯或誘導CD45RA+和CD62L+的表達，從而獲得CD45RA+CD62L+γδT 細胞和CD62L+γδT 細胞。

本研究結論是TWS119 可以活化γδT 細胞Wnt/β-catenin 信號通路，在一定濃度范圍內能促進γδT 細胞增殖和提高γδT 細胞純度，同時能劑量依賴性調控CD45RA 和CD62L 的表達獲得CD45RA+CD62L+γδT 細胞和CD62L+γδT 細胞。我們研究結果為進一步提高γδT 細胞治療腫瘤提供了實驗依據。但有關該群細胞具體的生物學特性、體內抗腫瘤療效以及今后的于臨床腫瘤試治等有待進一步研究。

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