多囊卵巢綜合征大鼠AMH 表達與胰島素抵抗的相關性研究

李曉紅 閆 宏 溫泰芳 (深圳市龍崗區婦幼保健院生殖內分泌科，深圳518172)

PCOS 是一種內分泌障礙性疾病，主要發生在育齡期婦女，發病原因及機理目前尚不明確，臨床表現具有高度異質性的特點，主要表現為月經不調、排卵障礙和不孕，主要內分泌特征為高雄激素及高胰島素血癥，AMH 是反映多囊卵巢綜合征的一個重要的激素，是卵巢局部的一種重要的調節因子，有學者研究認為AMH 水平隨著雄激素的升高而變化［1］，另有學者研究認為PCOS 患者胰島素抵抗程度與雄激素水平呈相關性［2］。而AMH 與IR 是否有相關性目前報道相對較少，本研究采用RT-PCR 法探討多囊卵巢綜合征大鼠AMH 表達與胰島素抵抗的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 SD 雌性大鼠60 只，隨機選擇40只采用DHEA 皮下注射法制作PCOS 大鼠模型，作為實驗組;20 只正常SD 雌鼠作為對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCOS 模型制作 23 日齡左右的SD 大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，具體方法如下:將DHEA 溶于0.2 ml 甘油中，對照組皮下注射0.2 ml甘油，均于上午10 時連續皮下注射21 d;空白對照組正常飼養，停藥后，連續陰道涂片7 d，藥物注射結束后，根據大鼠陰道上皮細胞是否存在周期性的變化來判定是否造模成功。

1.2.2 相關激素指標測定 對造模成功的大鼠及正常對照大鼠通過陰道涂片觀察周期性變化，選擇動情間期的大鼠作為研究對象，晚上8∶ 00 禁食后，并稱取體重，第二天通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟取血6～10 ml，血樣靜置30 min，以3 000 r/min的轉速離心10 min，提取上清液。采用放射免疫法測定血清黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH);采用酶聯免疫法測定空腹血糖值(Fasting blood glucose，FPG)、血胰島素(Fins)和AMH;采用化學發光法測定血清E2、PT。根據HOMA-IR 的計算公式(HOMA-IR=FPG × FINS/22.5)計算HOMA-IR 指數值。所有PCOS 模型均經過病理證實為PCOS 大鼠，根據HOMA-IR 值由大到小排列順序，前20 只與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，說明為PCOS合并IR 組;后20 只與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，判定為PCOS 無IR 組;對照組20 只。

1.2.3 標本采集及病理檢測 對已經采集血清的大鼠進行雙側卵巢解剖，盡量將卵巢周圍的附帶組織去除干凈后置于10%甲醛液中，固定24 h 后進行切片，厚度4 mm，切取卵巢的最大平面進行常規石蠟包埋，分別切取3 片，2 片進行免疫組化檢測，1 片進行HE 染色形態學觀察。

1.2.4 免疫組化檢測 根據DAB 試劑盒的操作步驟進行操作，實驗濃度為1∶ 20，AMH 受體表達陽性的判定標準為在細胞質中有棕黃色或棕褐色顆粒出現，采用image analysis-microarray 計算機圖像分析系統進行圖像分析，隨機選擇2 000 倍視野下的5個單卵泡視野，半定量分析AMH 的表達水平。陽性單位(PU)=(待測部分的平均灰度-背景平均灰度)/ 256 ×100，256 為檢測高倍鏡的最大灰度。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0 進行統計學分析，對符合正態分布的計量資料采用t 檢驗和方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗，不符合正態分布采取秩和檢驗，對相關指標進行Pearson 相關性分析和直線回歸分析。P＜0.05 判定差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清學指標檢測 從表1 中可以看出單純PCOS 組、PCOS 合并IR 組和對照組FSH、FPG 相比差異無統計學意義(P ＞0.05);PCOS 大鼠無論是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明顯高于對照組，相比差異有統計學意義(P＜0.05)，而PCOS 合并IR 組T、Flns 及HOMA-IR 較對照組明顯升高，相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 三組血清AMH、卵巢局部AMH 及胰島素受體表達、單卵泡AMH 及胰島素受體表達比較 從表2中可以看出PCOS 大鼠無論是否合并IR 血清AMH、卵巢局部AMH 均高于對照組，相比差異有統計學意義(P＜0.05);PCOS 合并IR 組明顯高于單純PCOS 組，相比差異有統計學意義(P＜0.05);三組間卵巢局部胰島素受體、單卵泡AMH 及單卵泡胰島素受體相比差異無統計學意義(P ＞0.05)。

2.3 AMH 與胰島素、胰島素受體表達相關性分析 經過Pearson 相關性分析結果顯示血清AMH 表達強度與胰島素表達強度無明顯相關性(r=0.015，P ＞0.05);卵巢局部AMH 表達與胰島素受體有明顯相關性(r=0.671，P=0.003);單卵泡AMH 表達強度與胰島素受體表達強度無明顯相關性(r=0.011，P ＞0.05);而對血清AMH 的表達與HOMA-IR 進行Pearson相關性分析結果顯示HOMA-IR 與血清AMH 之間存在明顯的正相關性(r=0.683，P=0.001)。

表1 三組血清學指標比較Tab.1 Compares three groups of serological markers

表2 三組空腹胰島素、卵巢局部AMH 及胰島素受體表達、單卵泡AMH 及胰島素受體表達比較Tab.2 Three fasting insulin，insulin receptor expression in local AMH and ovarian follicle single AMH and insulin receptor expression in comparison

2.4 血清AMH 與HOMA-IR、血清T 及胰島素多元回歸分析 經過逐步回歸篩選，血清T 不符合回歸方程，變量HOMA-IR 和胰島素符合回歸方程，經方差分析，F=12.37，P=0.000 1，因此血清AMH與HOMA 指數和血清胰島素之間可能存在直線關系，將其代入多元回歸方程AMH=15.676 HOMAIR+4.683 FINS -72.112，兩變量的偏回歸系數分別為15.661 和4.682，因此，HOMA-IR 對血清AMH的影響與胰島素相比無明顯統計學意義(P ＞0.05)。

3 討論

PCOS 是育齡期婦女常見的一種疾病，主要特征為排卵障礙、高雄激素血癥、胰島素抵抗及卵巢多囊性改變，發病率為5%～10%，但發病原因及機理目前尚不明確。AMH 是轉化生長因子超家族中的一員，是一種二聚體糖蛋白，高表達于卵巢竇前卵泡和小竇狀卵泡上，女性開始青春期發育時，AMH 的表達水平已經開始逐步上升，最終到達基礎水平，該水平維持整個生育期。PCOS 的診斷標準中無AMH的相關說明，但從眾多的研究中發現AMH 在PCOS的代謝功能紊亂及相關遠期并發癥的發生發展中有不可忽視的作用。有學者研究認為PCOS 患者AMH 水平較正常女性高2～3 倍［3］。

本研究結果顯示PCOS 大鼠無論是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明顯高于對照組，相比差異有統計學意義(P＜0.05)，而PCOS 合并IR 組T、Flns 及HOMA-IR 較對照組明顯升高，相比差異亦有統計學意義(P＜0.05)。

PCOS 大鼠血清AMH 升高可能是導致排卵障礙的原因之一，可能機理是與正常卵巢相比PCOS卵巢存在較多的停滯不前的竇前卵泡，因此，AMH分泌增多，導致卵泡發育及排卵障礙，進而導致更多的不成熟卵泡，AMH 分泌也逐漸增多。有學者研究表明PCOS 患者血清中AMH 表達水平與雄激素和胰島素水平呈正相關［4］。本研究結果顯示:PCOS大鼠無論是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明顯高于對照組，相比差異有統計學意義(P＜0.05)，表現為代償性胰島素升高(CHI)，而空腹血糖無顯著差異。有學者研究顯示胰島素升高能夠促進卵泡募集［5］，卵泡募集導致小竇卵泡和竇前卵泡增多，進而增加AMH 分泌，而AMH 具有抑制顆粒細胞芳香化酶的作用，進而降低卵泡對FSH 的敏感性，雄激素的合成增加，最終導致小竇卵泡數目增多，AMH的產生相應也增多。上述結果說明:AMH 和胰島素相互作用可能是導致PCOS 患者雄激素升高的原因，三者之間可能具有相互作用、相互影響的關系。

目前對于PCOS 患者單個卵泡AMH 水平各個學者無統一的標準，有學者研究表明PCOS 患者單個卵泡AMH 會顯著升高［1］，另有學者認為AMH 的水平只是與小卵泡的數量有關，而單個卵泡分泌AMH 的水平無明顯改變［6］。從臨床治療的結果上也可以看出，采用胰島素增敏劑治療PCOS 患者，可以有效降低高胰島素血癥，減少竇前卵泡的數量，從而改善胰島素抵抗［7］，而長期的二甲雙胍治療是否能夠降低AMH 水平還有待于進一步觀察［8］。本研究結果顯示，PCOS SD 大鼠單個卵泡AMH 表達水平與正常大鼠AMH 表達相比差異不明顯。可能是由于在卵泡早期，雄激素的水平升高，導致多個小卵泡生長，卵泡的數量增加，但單個卵泡表達的AMH 水平無變化，但是隨著小卵泡數量的不斷增多，卵巢局部AMH 水平表達增多，胰島素受體也增多［9］。

胰島素受體在卵泡細胞膜表面及間質均有表達，對卵巢功能發揮著重要的調節作用。當機體出現胰島素抵抗時，胰島素代謝紊亂［10］。早期認為PCOS 代償性高胰島素將降調節胰島素受體數目，胰島素抵抗可能是由于胰島素受體數目減少引起。本研究結果顯示，PCOS 大鼠與對照組相比，卵巢局部和單卵泡胰島素受體表達無差異，單卵泡AMH水平與胰島素受體表達無相關性，卵巢局部AMH表達與胰島素受體呈明顯相關性，因此，可以推測PCOS 卵巢局部AMH 的高表達可能與高胰島素血癥具有相關性，在AMH 與胰島素受體的相互作用下雄激素向雌激素的轉化受到阻滯，與高雄激素血癥之間形成正反饋調節作用［1］。

總之，PCOS 大鼠AMH 與血清胰島素水平呈正相關，卵巢局部AMH 表達與胰島素受體有正相關性，而單卵泡AMH 表達與胰島素受體無明顯相關性，對于是否與高雄激素有關，還需要進一步研究。

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