PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷組織中MPO 與NO 的影響①

呂曉珮 林妍娉 王羿斐 付開強 李偉詩 王 雨 曹榮峰

(青島農業大學動物科技學院，青島 266109)

隨著室內裝修的日益普及，甲醛已成為主要的室內空氣污染物，其對健康的影響不容忽視，吸入過量甲醛會導致肺炎和肺水腫。PDTC(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)，即吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽，是NF-κB 的特異性抑制劑，可以抑制NF-κB的活化，減輕炎癥反應;同時也是一種抗氧化劑，可以直接清除自由基和抑制自由基的產生［1］。研究發現，PDTC 可以抑制NF-κB 介導的小鼠急性呼吸窘迫綜合征的炎癥反應。而PDTC 是否對甲醛引起的肺急性炎癥也有抑制作用，其對肺組織MPO(Myeloperoxidase)與NO(Nitric oxide)的作用機理等問題值得進一步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 54 只8～12 周齡成年小白鼠，雌雄各半，購于青島市藥品檢驗所。置于動物房適應性飼養5 d，供應充足的飲水與食物。

1.1.2 試驗試劑與儀器 MPO 檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20140506)，NO 檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，甲醛溶液(Sigma 公司)，PDTC(碧云天生物技術研究所)，722G 可見分光光度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，T18 basic 高速分散機(德國IKA 公司)，酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)，100 μl 微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠急性肺損傷模型的建立 將30 只雌雄各半的小鼠隨機分成5 組，每組6 只，分別滴鼻PBS稀釋的不同劑量的甲醛(0、2.5、5.0、10.0 和20.0 mg)溶液20 μl，7 h 后取小鼠肺臟，稱重，按質量體積比加入9 倍體積的PBS 溶液，分散機攪拌制作組織勻漿，離心取上清。按照試劑盒說明檢測該組織中MPO 的活力及NO 的濃度。根據結果的統計分析，確定小鼠急性肺損傷模型建立的條件。

1.2.2 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷的影響 將24 只雌雄各半的小鼠隨機分成4 組，每組6只，分別為對照組、甲醛組、PDTC 組和PDTC +甲醛組。首先對PDTC+甲醛及PDTC 組腹腔注射100 mg/kg 的PDTC 溶液0.2 ml，1 h 后，甲醛組以及PDTC+甲醛組分別滴鼻10.0 mg 甲醛(模型篩選出的甲醛劑量)溶液20 μl，對照組和PDTC 組分別滴鼻PBS 溶液20 μl。7 h 后取小鼠肺臟，稱重，按質量體積比加入9 倍體積PBS 溶液，分散機攪拌制作組織勻漿，離心取上清。按照試劑盒說明檢測該組織中MPO 的活力及NO 的濃度。

1.3 統計學分析 數據資料用SPSS13 軟件進行統計學處理，用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結果

2.1 甲醛誘導小鼠急性肺損傷模型的建立

2.1.1 不同劑量甲醛刺激后小鼠肺臟MPO 活力的變化 不同劑量甲醛滴鼻小鼠后肺臟組織MPO 活力的變化結果見圖1。從圖1 可以看出，隨著甲醛劑量增加MPO 活力呈上升趨勢，5.0、10.0 mg 甲醛組與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，10.0 mg 甲醛組MPO 活力最高。而2.5 和20.0 mg 甲醛組MPO活力與對照組無顯著性差異(P ＞0.05)。

2.1.2 不同劑量甲醛刺激后小鼠肺臟NO 濃度的變化 不同劑量甲醛滴鼻小鼠后肺臟組織NO 濃度的變化結果見圖2。從圖2 可以看出，隨著甲醛劑量增加NO 濃度呈上升趨勢，2.5、5.0 和10.0mg 甲醛組與對照組相比均差異極顯著(P＜0.01)，10.0 mg 甲醛組NO 濃度最高。而20.0 mg甲醛劑量與對照組無顯著性差異(P ＞0.05)。

圖1 不同劑量甲醛對小鼠肺臟MPO 活力的影響Fig.1 Effects of MPO activity in lung tissue of mice with different doses of formaldehyde

圖2 不同劑量甲醛對小鼠肺臟NO 濃度的影響Fig.2 Effects of NO content in lung tissue of mice with different doses of formaldehyde

2.2 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷的影響

2.2.1 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷的MPO 活力的影響 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷的MPO 活力的影響結果見圖3。從圖3 可以看出，與對照組相比，甲醛組的MPO 活力極顯著升高(P＜0.01)，PDTC +甲醛組MPO 活力顯著升高(P＜0.05)，PDTC 組無顯著性變化(P ＞0.05)，說明甲醛能顯著升高MPO 的活力，單獨注射PDTC 對小鼠沒有顯著影響。與甲醛組相比，PDTC 和PDTC+甲醛組MPO 活力均極顯著降低(P＜0.01)，說明PDTC 能顯著降低甲醛誘導的小鼠肺臟MPO 的活力。

圖3 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷MPO 活力的影響Fig.3 Effects of PDTC on activity of MPO by formaldehyde-induced acute lung injury in mice

2.2.2 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷的NO濃度的影響 PDTC 對甲醛誘導的小鼠急性肺損傷的NO 濃度的影響結果見圖4。從圖4 可以看出，與對照組相比，甲醛組的NO 濃度極顯著升高(P＜0.01)，PDTC+甲醛組NO 濃度顯著升高(P＜0.05)，PDTC 組無顯著變化(P ＞0.05)，說明甲醛能顯著升高NO 的濃度，單獨注射PDTC 對小鼠沒有顯著影響。與甲醛組相比，PDTC 與PDTC +甲醛組的NO 濃度均極顯著降低(P＜0.01)，說明PDTC 能顯著降低甲醛誘導的小鼠肺臟NO 的濃度。

圖4 PDTC 對甲醛誘導的小鼠肺損傷模型NO 濃度的影響Fig.4 Effects of PDTC on content of NO by formaldehyde-induced acute lung injury in mice

3 討論

中性粒細胞聚集在炎癥部位產生MPO，MPO 催化過氧化氫和氯離子反應，產生次氯酸鹽殺滅微生物［2］，且可過量生成氧化劑導致組織氧化損傷［3］。動物炎癥試驗多把MPO 含量升高作為炎癥反應的標志。酵母混懸液誘導大鼠急性肺損傷試驗發現大鼠肺臟MPO 活力顯著增強［4］，本試驗用甲醛刺激小鼠肺臟后，MPO 活力也明顯增強，說明甲醛能夠導致小鼠肺臟中性粒細胞聚集而發生炎癥反應。NO既可殺傷和清除異物，參與機體的免疫防御活動［5］，也可與過氧化物反應形成過氧亞硝酸鹽，損傷肺微血管內皮細胞，還能調節炎癥介質引起肺組織損傷［6］。高洪波等［7］研究發現，大鼠肢體缺血/再灌注后所造成的肺損傷中，肺臟NO 濃度顯著增加，這與本試驗甲醛誘導小鼠急性肺損傷后NO 濃度顯著增加相一致。所以，我們通過比較甲醛的劑量和作用時間，確定了甲醛建立小鼠急性肺損傷的最佳條件。

當機體受到刺激時NF-κB 被激活，活化的NFκB 進入細胞核內，誘導下游相關多種細胞因子、趨化因子、黏附因子等表達，引起中性粒細胞浸潤，釋放大量MPO。NO 主要是由iNOS 合成，iNOS 基因有NF-κB 位點，NF-κB 激活參與iNOS mRNA 的表達［8］。PDTC 作為NF-κB 的高效抑制劑，通過阻止IκBα 磷酸化而抑制NF-κB 激活［9］。欒正剛等［10］發現，PDTC 顯著降低重癥胰腺炎肺損傷的肺組織中MPO 活力和誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)表達。本研究發現，在甲醛滴鼻前1 h 注入PDTC，也顯著降低了小鼠肺臟中MPO 的活力與NO 的濃度，說明PDTC 對MPO 和NO 的抑制作用可能是通過調控NF-κB 實現的。PDTC 同時具有抗氧化作用，而NO在研究中也常作為氧化指標。PDTC 也可能通過其抗氧化作用清除局部過剩的氧自由基NO，從而預防了由于NO 增高導致的氧化應激損傷［11］。

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［7］高洪波，趙林靜，董淑云，等.缺血預適應對大鼠肢體缺血/再灌注后肺損傷的影響［J］.中國應用生理學雜志，2008，24(4):439-441.

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［11］李傳剛，張萌佳，舒曉宏，等.吡咯烷二硫氨基甲酸對小鼠大劑量順鉑腎毒性損傷的防治作用［J］.大連醫科大學學報，2010，32(4):388-391.