RNA 干擾Fascin1 表達抑制膠質瘤細胞U87 MG 的侵襲、轉移能力

李培棟 王新軍 單 嶠 吳躍輝 王 振 (鄭州大學第五附屬醫院神經外科，鄭州 450052)

神經膠質細胞瘤是最常見的原發性腦腫瘤，在顱內腫瘤中占50%以上［1］。近年來，盡管在膠質瘤的多模式治療方面有很大的進步，但其臨床治療效果及生存率仍不夠理想［2］。膠質瘤細胞的高浸潤特性——侵襲腫瘤周圍的大腦實質，是治療失敗和腫瘤復發的一個主要原因［3，4］。

膠質瘤細胞的侵襲和轉移，是一個多因子參與的過程。肌動蛋白細胞骨架網絡在細胞運動中發揮了重要作用，這也是調節細胞轉移、侵襲的重要機制之一［5］。Fascin1 是肌動蛋白結合的細胞骨架蛋白，它參與細胞絲狀偽足形成，很可能促進細胞的遷移運動。生理狀態下，Fascin1 在大腦的神經元、膠質細胞、內皮細胞中表達較高［6-9］。Fascin1 的異常表達增高可見于乳腺癌、肺癌、卵巢癌和結腸癌等腫瘤中［10-13］。有研究指出，Fascin1 的表達增高與膠質細胞瘤的分級相關［14，15］。Jeong Hyun Hwang 等也在研究中表明，Fascin1 參與了膠質瘤細胞轉移、侵襲時的細胞形態重塑與骨架重塑。然而，關于異常增高的Fascin1 促進膠質瘤細胞轉移和侵襲的機制，我們知之甚少。

因此，在本研究中，我們應用RNA 干擾技術，使膠質瘤細胞U87 MG 中的Fascin1 特異性地表達降低，評估其對U87 MG 細胞轉移和侵襲能力的影響，并進一步探討Fascin1 發揮作用的機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 人惡性膠質瘤細胞株U87 MG 購自American Type Culture Collection 公司。根據后續實驗將細胞分為3 組:空白對照組(未轉染的膠質瘤細胞)、陰性對照組(轉染neg-siRNA 的膠質瘤細胞)、實驗組(轉染Fascin1-siRNA 的膠質瘤細胞)。

1.2 主要試劑 DMEM/HIGH GLUCOSE 培養基、胎牛血清和青鏈霉素混合液(100 ×)購自HyClone公司;Lipofectamine 2000、Opti-MEM 減血清培養基、針對Fascin1 的特異性siRNA 及陰性對照RNA 均購自Life Technologies;RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;蛋白酶抑制劑購自Roche 公司;小鼠抗Fascin1 單克隆抗體購自Abcam 公司;小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體購自生工上海股份有限公司;兔抗人AKT、p-AKT、p-STAT3、STAT 購自Cell Signaling 公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG 均購自聯科生物技術有限公司;化學發光試劑購自南京凱基生物科技發展有限公司;針對PI3K/AKT 通路的抑制劑LY294002 購自SIGMA-ALDRICH 公司;針對STAT3 通路的抑制劑JSI-124 購自Calbiochem公司;24-Well Cell Migration and Invasion 試劑盒購自cell biolabs。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠質瘤細胞株的培養 人膠質瘤細胞株U87 MG 培養于含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 鏈霉素雙抗的高糖DMEM 完全培養液中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。根據細胞培養情況，3～4 d 進行一次傳代，取對數生長期、健康的細胞進行后續實驗。

1.3.2 細胞轉染 本實驗將3 條靶向Fascin1 基因的特異性siRNA 轉入細胞，并篩選出對Fascin1 表達抑制最有效的一條。轉染前取對數生長期、健康的膠質瘤細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE 培養液懸浮后，以2 ×105個/孔的密度接種于6 孔板中。Lipofectamine 2000 用Opti-MEM 預混后，靜置5 min，加入Opti-MEM 稀釋后的Fascin1-siRNA 和neg-siRNA 并混勻，室溫靜置20 min。將混合物按分組加入含膠質瘤細胞的6 孔板中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，48 h 后收集細胞進行后續試驗。

1.3.3 蛋白質免疫印跡法檢測細胞中蛋白的表達 用1 ×PBS 充分洗滌細胞，再用含有1 ×蛋白酶抑制劑PIC 的RIPA 裂解液裂解細胞抽提總蛋白。細胞裂解液用BCA 法檢測蛋白濃度。取30 μg 總蛋白與6 ×SDS-PAGE 上樣緩沖液混合后，在95℃的加熱儀上加熱5 min，再加至10%SDS-PAGE 膠上進行電泳，然后將蛋白電轉至PVDF 膜上。電轉后的PVDF 膜用含5%BSA 的TBST 封閉1 h，再分別加入1∶500～1∶2 000 稀釋后的相應的一抗，將PVDF 膜置于搖床上，4℃孵育過夜。次日，經TBST 充分洗滌后(10 min/次，共3 次)，分別加入相應HRP 標記的二抗(稀釋比例為1∶5 000)，再將PVDF 膜置于搖床上，室溫孵育1 h。再次充分洗膜。最后用化學發光法顯色并用ECL 凝膠成像系統(ECL，USA)采集圖像。實驗獨立重復3 次。

1.3.4 transwell 小室法檢測細胞轉移、侵襲能力 取轉染48 h 后的膠質瘤細胞，用DMEM/HIGH GLUCOSE 培養液懸浮后進行臺盼藍染色，鑒定細胞存活率為95%以上。根據transwell 說明書進行實驗操作。細胞計數后，按照前述分組，以5 ×105個/孔的密度將細胞接種于含有和不含有基質膠的transwell 的上室中，分別用于測定膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力;在下室中加入含10% 胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE 培養液。將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。分別于鋪板后12 h、24 h 對穿膜的膠質瘤細胞進行染色，并用酶標儀測定其OD 值。實驗獨立重復3 次。

1.4 結果判定

1.4.1 Western blot 技術圖像分析 顯像結果經Quantityone 軟件進行圖片分析、計算凈光密度值。并以Bio-Image Analysis System 進行半定量分析，結果以相對光密度值(Relative optical density，ROD)×面積(mm2)表示。蛋白的相對含量=(目的蛋白條帶ROD ×mm2)/(GAPDH 條帶ROD×mm2)。

1.4.2 遷移、侵襲實驗結果判定 用試劑盒自帶的細胞染色液(Cell stain solution)對穿膜的細胞進行染色，再用試劑盒的脫色液(Extraction solution)進行脫色，用酶標儀檢測各組脫色液在560 nm 吸光度時的OD 值，并對OD 值的結果進行比較分析。處理因素對細胞遷移/侵襲能力的抑制率=(對照組OD 值-實驗組OD)/對照組OD 值×100%。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據的統計分析。計量資料以±s 表示，組件比較采用t 檢驗觀察其統計學差異，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 特異性siRNA 對Fascin1 蛋白表達抑制的驗證 用Fascin1-siRNA 轉染U87 MG 細胞48 h 并提取細胞裂解液，用Fascin1 特異性抗體，通過免疫印跡檢測Fascin1 蛋白的表達水平。結果表明，經特異性siRNA 轉染后，細胞內Fascin1 水平顯著降低(圖1)，且以第3 條序列的抑制效果最佳，敲除Fascin1后其表達水平是未敲除細胞的(0.21 ±0.06)倍，P＜0.05，故選擇該條序列對膠質瘤細胞進行Fascin1基因敲除，進行后續實驗。

2.2 Fascin1 低表達對U87 MG 細胞侵襲、轉移能力的影響 用Fascin1-siRNA 轉染U87 MG 細胞48 h 后，將胰酶消化并重懸后的細胞接種于含有或不含有基質膠的上室中，檢測膠質瘤細胞侵襲、轉移能力的變化。結果表明，相比空白對照組和陰性對照組，實驗組細胞的轉移能力降低了約(49 ±5.8)%及(46 ±5.4)%(P＜0.05)，侵襲能力降低了約(42±4.9)%和(43 ±4.8)%(P＜0.05)，見圖2，這說明Fascin1 能夠顯著促進U87 MG 細胞的侵襲和轉移。

2.3 免疫印跡法檢測各組細胞內p-AKT 和p-STAT3 的表達水平 取Fascin-siRNA 轉染48 h 后的細胞裂解液，經Western blot 法驗證后顯示，Fascin1-siRNA 轉染后的膠質瘤細胞相較于陰性對照或空白對照組的細胞，其AKT 蛋白和STAT3 蛋白的磷酸化均有明顯減少，分別是對照組的(0.32 ±0.08)倍和(0.07 ±0.03)倍，P＜0.05，見圖3。上述結果表明，抑制膠質瘤細胞Fascin1 蛋白的表達，會減弱相關通路蛋白AKT 和STAT3 的活化。

圖1 Western blot 法檢測RNA 干擾后Fascin1 的敲除率及條帶灰度值比Fig.1 Western blot analysis assess knockdown efficiency of Fascin1-siRNA

圖2 侵襲和轉移的U87 MG 細胞的OD 值檢測Fig.2 OD value of migratory and invasive U87 MG cells

圖3 Western blot 法檢測RNA 敲除Fascin1 后蛋白的表達變化Fig.3 Assessing expression of proteins post Fascin1-siRNA transfection by using Western blot analysis

圖4 抑制AKT 和STAT3 的磷酸化對U87 MG 細胞轉移和侵襲能力的影響Fig.4 Impact on migration and invasion capacity of U87 MG cells by inhibiting phosphorylation of PI3K/AKT pathway and STAT3 pathway

2.4 抑制AKT 和STAT3 的磷酸化對膠質瘤細胞侵襲、遷移能力的影響 將未處理的膠質瘤細胞在DMEM/HIGH GLUCOSE 培養液中懸浮后接種于含有和不含有基質膠的transwell 小室的上室中，培養4 h 后向實驗組的上室中分別加入AKT 的抑制劑和STAT3 的抑制劑。20 小時后測定穿膜細胞的OD值，結果表明，和對照組相比，抑制實驗組細胞的AKT 和STAT3 磷酸化后，也顯著抑制了膠質瘤細胞的遷移能力［LY294002 抑制(75 ± 7.6)%，P＜0.05;JSI-124(61 ±5.9)%，P＜0.05］和侵襲能力［LY294002 抑制(63.5 ±6.1)%，P＜0.05;JSI-124(59 ±5.7)%，P＜0.05］(圖4)。由此表明，AKT 和STAT3 等相關信號通路分子的激活，會促進膠質瘤細胞的侵襲和轉移能力。

3 討論

膠質瘤是最常見的腦腫瘤之一，膠質瘤細胞的高遷移、侵襲能力被認為是影響治療和腫瘤復發的關鍵因素。肌動蛋白結合蛋白Fascin1 在神經系統中廣泛表達，對神經元的運動和突觸可塑性有重要作用［6-9］。近來研究表明，Fascin1 在多種腫瘤中異常高表達，與腫瘤的侵襲和轉移有密切關系［16-18］。在膠質瘤中，Fascin1 的表達較生理水平時升高，使絲狀偽足和板狀偽足形成增多，從而促進腫瘤細胞運動［19］。本研究采用RNAi 技術抑制膠質瘤細胞株中Fascin1 的表達，在Fascin1 被抑制后，膠質瘤細胞U87 MG 細胞的侵襲和轉移能力均有顯著下降，與前述研究結果一致，表明膠質瘤中Fascin1 的高表達會促進腫瘤細胞向周圍的腦實質轉移和浸潤。

腫瘤細胞的轉移和浸潤是多因子、多信號通絡參與的腫瘤進展過程，其中，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT、JAK/STAT3 通路的異常激活可促進多種腫瘤細胞浸潤。Aye Aye Thant 在研究中指出，通過添加針對PI3K通路的抑制劑Wortmannin 和LY294002，可以使FN1蛋白引起的卵巢癌細胞株NOM1 的侵襲能力增強這一效應得到逆轉［20］。此外，IL-6 可通過激活PI3K/AKT 和JAK/STAT3 通路的磷酸化，增強膠質瘤細胞的侵襲及轉移能力，而添加了兩條通路的抑制劑后，則可逆轉IL-6 引起的效應［21，22］。鑒于這兩種信號通路在腫瘤發生發展中的重要作用，本研究觀察了抑制U87 MG 中Fascin1 的表達后，AKT 和STAT3 磷酸化水平的變化。蛋白質印跡法結果表明，Fascin1 表達抑制后，腫瘤細胞內AKT 和STAT3的磷酸化水平顯著降低，且單獨使用針對PI3K 通路的抑制劑LY294002 和針對STAT3 通路的抑制劑JSI-124 后，可觀察到AKT 和STAT3 激活減少，U87 MG 的浸潤、轉移能力顯著降低，表明PI3K/AKT 通路及STAT3 通路的激活在膠質瘤細胞的侵襲和轉移中發揮了重要的作用。

綜上所述，Fascin1 的高表達與膠質瘤細胞的侵襲、轉移能力密切相關。本研究使用的針對Fascin1的特異性siRNA 能有效降低Fascin1 的表達，進而通過抑制相關的PI3K/AKT 信號通路和STAT3 信號通路的激活，減弱了膠質瘤細胞U87 MG 的侵襲及轉移能力。Fascin1 在多種腫瘤中表達增高，且被認為與膠質瘤的分級正相關，以Fascin1 為靶標的新療法可能成為治療Fascin1 高表達腫瘤的突破點。本研究揭示了Fascin1 對膠質瘤細胞某些腫瘤特性的部分分子機制，然而體外細胞模型存在系統簡單、環境單一的缺陷，與體內實驗相比存在潛在差異。因此，對于Fascin1 發揮作用的更全面的分子機制，及Fascin1 在動物模型中發揮的作用仍需進一步研究。

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