外周血濾泡輔助性T 細胞與B 細胞在酒精性股骨頭壞死患者中的作用

丁福鵬 戚長林 高 輝 劉易軍 王 井 單玉興 (吉林大學第一醫(yī)院分院骨科，長春 130021)

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死是以漸進性股骨頭塌陷為特征的嚴重的慢性疾病［1］，疾病早期進展隱匿沒有明顯的臨床癥狀，后期只能通過人工髖關節(jié)置換手術治療來緩解癥狀和恢復功能，但是該手術給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔并帶有長期的并發(fā)癥。非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機制并不明確，但飲酒是公認的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要病因之一，酒精可能通過加重血管內凝血進而導致骨質缺血和壞死，但其具體機制并不明確［2，3］。濾泡輔助性T 細胞(Tfh)是最近發(fā)現的對B 細胞的分化、抗體生產和體液免疫具有重要調節(jié)作用的細胞，Tfh細胞表面表達趨化因子受體5(CXCR5)，可誘導輔助刺激因子(ICOS)和程序性死亡因子(PD)-1 并以分泌IL-21 為特征［4］，本研究通過分析酒精性股骨頭壞死患者外周血中Tfh 細胞和B 細胞的變化情況，來探究Tfh-B 細胞間相互作用在酒精性股骨頭壞死的發(fā)病機制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 26 例酒精性股骨頭壞死患者來自吉林大學第一醫(yī)院住院部及門診，其中男性24 例，女性2 例，年齡49(40～70)歲;選取15 名健康者作為健康對照組，男性12 名，女性3 名，年齡48(36～68)歲。病例組和健康對照組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。診斷均符合Mont 提議的診斷標準［5］，患者酗酒超過十年，每日飲白酒量大于0.25 kg/dof，病人的疾病等級分期參照FICAT 分期標準［6］，股骨頭塌陷指數參照Deng JC 提出的標準評價［7］。排除創(chuàng)傷性股骨頭壞死、骨腫瘤、強直性脊柱炎、先天髖關節(jié)發(fā)育不良、髖關節(jié)骨性關節(jié)炎、慢性炎癥、自身免疫性疾病及近期感染的患者。本研究符合中國醫(yī)學倫理委員會制定的倫理標準，并獲得倫理委員會的批準。標本采集均取得受試者的知情同意。

1.2 外周血單核細胞(PBMC)分離 治療前靜脈抽取新鮮全血(枸櫞酸鈉抗凝)6 ml，通過梯度離心法獲得外周血單個核細胞(PBMCs)，在含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液(Hyclone，Waltham，MA，USA)中培養(yǎng)PBMCs，加入50 ng/ml phorbol myristate acetate(PMA)和2 g/ml 離子霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)刺激1 h，加入布雷菲德菌素A(10 g/ml，GolgiStop，BD Sciences，San Jose，CA，USA)培養(yǎng)5 h，收集調成細胞數約為1 ×107ml-1的懸液備用。

1.3 流式細胞術檢測Tfh 細胞 分離后PBMCs 加入Alexa Fluor 647 抗CXCR5 抗體，藻紅蛋白(PE)/CY7 抗CD4 抗體，PE 抗CD278 抗體，和異硫氰酸熒光素(FITC)抗CD279 抗體(BD PharMingen，San Diego，CA，USA)在室溫下避光染色30 min。同型對照組加入FITC 抗IgG1 抗體，PE 抗IgG1 抗體，PE/CY7 抗IgG1 抗體和Alexa Fluor 647 抗IgG1 抗體(BD PharMingen)。收集刺激后的PBMCs，加入Alexa Fluor 647 抗CXCR5 抗體，PE/CY7 抗CD4 抗體在室溫下避光染色30 min，固定破膜后PE 抗IL-21抗體胞內染色。流式細胞檢測分析IL-21+Tfh 細胞比率。

1.4 流式細胞術檢測B 細胞 分離后PBMCs 加入多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)抗CD19 抗體，FITC-抗CD86 抗體，PE-抗CD27 抗體，別藻藍蛋白(APC)抗CD95 抗體(BD PharMingen)在室溫下避光染色30 min，同型對照組加入FITC-IgG1 抗體，PE 抗Ig2a 抗體，PerCP 抗IgG1 抗體，和APC 抗IgG1 抗體(BD PharMingen)染色。選取CD4+細胞設門，FlowJo 軟件(v7.6.2)分析樣本中不同亞群CD19+B 細胞的數量。

1.5 細胞因子測定 嚴格按照人IL-21 ELISA 試劑盒(Roche Diagnostics，Lewes，UK)說明書檢測外周血中IL-21 濃度。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 軟件包進行統(tǒng)計分析，數據采用中值及其范圍表示，進行獨立樣本t檢驗和秩和檢驗。相關性分析采用Spearman 秩和相關分析，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 酒精性股骨頭壞死中不同B 細胞亞群的變化情況及其與疾病進展的相關性 酒精性股骨頭壞死患者外周血CD19+B 細胞百分率顯著高于健康對照組(圖1B;t=3.765，P=0.000 5)，分析B 細胞不同亞群在酒精性股骨頭壞死中的變化情況，發(fā)現CD27+CD19+B 細胞相對于健康對照組明顯減少(圖1C;t=3.027，P=0.004)，CD86+CD19+B 細胞和CD96+CD19+B 細胞百分率顯著高于健康對照組(圖1D、E;t=5.506，P ＜0.000 1;t=4.152，P=0.000 2)，相關性分析顯示CD86+CD19+B 細胞百分率與股骨頭壞死評分呈正相關(圖1F;P ＜0.000 1，r=0.536)。

2.2 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細胞亞群和血清IL-21 水平的變化情況 酒精性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細胞百分率顯著高于健康對照組(圖2B;t=7.611，P ＜0.000 1)，同時PD-1+Tfh 細胞和IL-21+Tfh 細胞百分率顯著高于健康對照組(圖2C、E;t=4.369，P ＜0.000 1;t=0.989，P ＜0.000 1)，然而患者及健康對照組間比較ICOS+Tfh 細胞百分率并無顯著變化(圖2D;t=0.989，P=0.328)，患者血清IL-21 水平明顯高于健康人(圖2F;t=23.03，P ＜0.000 1)。

2.3 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細胞亞群的變化情況與不同B 細胞亞群的變化情況的相關性相關性分析顯示，酒精性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細胞百分率與CD19+B 細胞百分率呈正相關(圖3A;P=0.000 2，r=0.455)，外周血IL-21+Tfh細胞百分率與CD86+CD19+B 細胞百分率呈正相關(圖3B;P=0.000 2，r=0.447)。

圖1 酒精性股骨頭壞死中不同B 細胞亞群的變化情況及其與疾病進展的相關性分析Fig.1 Analysis of different subsets of B cells between NONFH patients and HC，and correlation between B cells and indices of femoral head collapse

圖2 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細胞亞群和血清IL-21 水平的分析Fig.2 Analysis of different subsets of Tfh cells and serum IL-21 levels between NONFH patients and HC

圖3 酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細胞亞群與不同B 細胞亞群的相關性分析Fig.3 Correlations between different subsets of Tfh cells and CD19 +B cells

3 討論

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死是臨床上常見的慢性疾病，發(fā)病機制不清且致病因素復雜。眾多學者發(fā)現非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者中存在免疫失衡的現象，免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等易并發(fā)股骨頭壞死［8，9］，外周血升高的細胞因子被證明與股骨頭的破壞有關，抗磷脂抗體和抗心脂抗體也被發(fā)現參與股骨頭壞死的發(fā)病及進展。飲酒是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要病因之一，Okazak 等［10］在研究酒精性骨壞死時發(fā)現酒精濫用通過LPS 相關通路誘導IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、IFN-γ 和TNF-α 的分泌，從而導致股骨頭的破壞，同樣有研究證明酒精濫用可通過Toll 樣受體4(TLR4)通路引起系統(tǒng)性的炎癥［11］。眾所周知，LPS 通過TLR4 對B 細胞具有激活作用［12］。可見B 細胞可能參與酒精性非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病及進展。

我們的研究發(fā)現酒精性非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者外周血CD19+B 細胞顯著高于健康對照組，進一步分析發(fā)現患者外周血CD95+CD19+B 細胞和CD86+CD19+B 細胞百分率相對于健康對照組顯著增高，然而患者外周血CD27+CD19+記憶性B 細胞顯著減少。有研究者證明CD27+B 細胞易在活化B細胞的刺激下分化為漿細胞［13］，這與我們的發(fā)現相符，在酒精性股骨頭壞死的病理狀態(tài)下，記憶性B細胞可能再次活化分化為漿細胞，導致體內CD27+CD19+記憶性B 細胞的減少。同時我們發(fā)現在酒精性股骨頭壞死患者中CD86+CD19+B 細胞與股骨頭塌陷指數呈正相關，這說明B 細胞在酒精性股骨頭壞死發(fā)病及發(fā)展中具有重要的作用。

Tfh 細胞是最近發(fā)現的對B 細胞的分化、抗體生產和體液免疫具有重要調節(jié)作用的CD4+T 細胞，Tfh 細胞通過表面表達的CXCR5、PD-1 和ICOS 調節(jié)生發(fā)中心中B 細胞的活化［14］，同時Tfh 細胞可分泌IL-21。IL-21 參與Tfh 細胞的產生分化和細胞增殖，并在生發(fā)中心形成及免疫球蛋白的類別轉換過程中發(fā)揮著重要作用［15］。有研究者發(fā)現Tfh 細胞和IL-21 在類風濕關節(jié)炎的關節(jié)炎癥和骨質破壞中發(fā)揮著重要的作用［16，17］。本研究發(fā)現酒精性非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細胞顯著高于健康對照組，且PD-1+Tfh 細胞和IL-21+Tfh 細胞百分率顯著高于健康對照組，然而患者及健康對照組間比較ICOS+Tfh 細胞百分率并無顯著變化。過去的研究證明免疫的失衡在NONFH 的疾病進展中發(fā)揮著重要的角色，升高的Tfh 細胞可能也參與酒精性股頭壞死進展。為了更好地探究Tfh 細胞在酒精性股骨頭壞死發(fā)病機制中發(fā)揮的作用，我們進一步分析了酒精性股骨頭壞死中不同Tfh 細胞亞群的變化情況與不同B 細胞亞群的變化情況的相關性，發(fā)現酒精性股骨頭壞死患者外周血Tfh 細胞百分率與CD19+B 細胞百分率呈正相關，IL-21+Tfh 細胞百分率與CD86+CD19+B 細胞百分率呈正相關，這提示Tfh 細胞通過誘導細胞因子的分泌和B 細胞的活化參與酒精性股骨頭壞死的發(fā)病及進展。

過量的酒精攝入造成體外循環(huán)的炎癥狀態(tài)［10］，Tfh 細胞數目增高并分泌大量IL-21，誘導B 細胞的活化，Tfh-B 細胞相互作用導致患者體內免疫失衡。Kwok［18］發(fā)現IL-21 不僅上調RANKL(核因子κ B受體活化因子配體)的表達，而且可以在缺乏RANKL 的情況下誘導破骨細胞的分化，B 細胞也表達RANKL［19］。眾所周知，體內升高的RANKL，會導致破骨細胞的激活，從而引發(fā)骨壞死，從而加重股骨頭壞死。Tfh-B 細胞可能在酒精性股骨頭壞死的發(fā)病和發(fā)展過程中具有重要的作用。

綜上所述，酒精性股骨頭壞死患者體內Tfh 細胞和B 細胞均高于健康對照組，并且Tfh 細胞與B細胞在疾病的發(fā)展過程中相互作用，可能在酒精性股骨頭壞死的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，然而Tfh-B 細胞在酒精性股骨頭壞死疾病中的具體機制仍需進一步研究。因此，對Tfh-B 細胞的相互作用進一步的研究對控制和治療酒精性股骨頭壞死具有重要意義。

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