CD4+ CD25+ Foxp3+ 調節性T 細胞在HDCP 外周血中水平變化及其意義

張義東 王青青 (浙江省德清縣人民醫院，德清 313200)

妊娠期高血壓疾病是指血壓正常婦女在懷孕20 周后發生血壓升高、雙下肢嚴重水腫和蛋白尿等癥狀，該病是妊娠婦女的特有疾病，嚴重危及母嬰的健康，也是產婦和圍生兒死亡的重要原因。隨著人們對規范產檢的重視逐漸提高，HDCP 的發病率呈上升趨勢。HDCP 的發病機制和致病因素至今尚不清楚，故臨床上針對該病并無很好的預防措施。胚胎在子宮腔內成功的生長發育與母體的免疫耐受有著莫大的關系，如果母體的免疫耐受發生紊亂，可引起孕婦發生自然性流產和HDCP 等病理性妊娠［1］。CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞在機體的免疫耐受中起到重要作用［2］。本文研究CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞在妊娠期高血壓疾病發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013 年1 月至2014 年8 月在我院治療的妊娠期高血壓疾病(HDCP)患者，納入標準:(1)診斷符合第7 版《婦產科學》關于HDCP 診斷標準;(2)患者均為初產婦，無其他產科并發癥;(3)患者及家屬知情同意，能配合研究。排除標準:(1)有肝腎心等重要臟器疾病;(2)結核以及血液系統疾病史;(3)有輸血及免疫治療史。本次研究共納入患者46 例，其中輕度子癇前期22 例，重度子癇前期24 例，同時選取同期正常孕婦25 例，三組孕婦在年齡、孕周等一般資料比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，見表1。

1.2 實驗儀器及試劑 FITC 熒光標記的抗人CD抗體、PE 標記的抗人CD25 抗體、PE-Cy5 標記的Foxp3 試劑盒。所有抗體均購自eBioscience 公司。

1.3 檢測方法 采用真空抗凝管抽取所有患者肘靜脈血5 ml 左右，采用淋巴細胞分離液制備外周血單個核細胞，采用PBS 洗滌后制備單細胞懸液。細胞表面染色:取150 μl 外周血單個核細胞懸液，加入2 ml PBS，1 000 r/min 離心5 min 后棄去上清，然后500 μl 的PBS 重懸將細胞稀釋到1 ×106ml-1，向其中加入10 μl 的FITC 標記的CD4 抗體和PE 標記的CD25 抗體，室溫避光30 min，加入2 ml 冷PBS，1 000 r/min，5 min 離心洗滌。細胞內染色:采用1 ml 破膜劑重懸細胞，室溫避光孵育1 h 后，加入1 ml透膜緩沖液，離心洗滌2 次后重懸，加入10 μl 的PE-Cy5 標記的Foxp3 抗體，室溫避光30 min，加入2 ml 冷PBS，1 000 r/min，5 min 離心，然后加入500 μl PBS 重懸。設置相應的對照管。流式細胞儀［BD FACSCALIBUR;BD Bioscience(U.S.A.)］檢測。

雌三醇水平測定:抽取所有患者肘靜脈血約5 ml，采用順磁性顆粒化學發光免疫測定法按照游離雌三醇定量檢測試劑盒(河南美凱生物科技有限公司，規格:48 人份/盒)的說明書進行操作測定患者外周血中游離雌三醇的水平。

1.4 統計學處理 應用采用SPSS19.0 統計軟件進行統計分析，計量資料采用±s 表示，比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD 檢驗，以P ＜0.05 表示差異具有統計學意義。

表1 三組一般資料比較(±s)Tab.1 Three groups general data comparison(±s)

表1 三組一般資料比較(±s)Tab.1 Three groups general data comparison(±s)

2 結果

2.1 各組外周血CD4+CD25+T 細胞比例情況 重度子癇前期組CD4+CD25+T 細胞比例為(5.01±1.04)%，低于輕度子癇前期組的(7.38±1.26)%和正常組的12.59±2.48)%，差異有統計學意義(P＜0.05);輕度子癇前期組CD4+CD25+T 細胞比例明顯低于正常組(P ＜0.05)。見表2。

2.2 各組外周血CD4+CD25+Foxp3+T 細胞情況輕度子癇前期組和重度子癇前期組CD4+CD25+Foxp3+T 細胞絕對數分別為(0.96±0.11)×107和(0.63± 0.12)× 107，CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 分別為(2.58±0.93)%和(1.84±0.85)%，均低于正常組的(1.85± 0.17)× 107和(5.11±0.99)%，差異有統計學意義(P ＜0.05);重度子癇前期組CD4+CD25+Foxp3+T 細胞絕對數和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 比例均低于輕度子癇前期組(P ＜0.05)。見表3，圖1。

表2 各組外周血CD4 +CD25 +T 細胞比例情況(±s)Tab.2 Each group peripheral blood CD4 + CD25 + T cell percentage(±s)

表2 各組外周血CD4 +CD25 +T 細胞比例情況(±s)Tab.2 Each group peripheral blood CD4 + CD25 + T cell percentage(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

表3 各組外周血CD4 +CD25 + Foxp3 +T 細胞情況(±s)Tab.3 Each groups peripheral blood CD4 + CD25 +Foxp3 +T cells(±s)

表3 各組外周血CD4 +CD25 + Foxp3 +T 細胞情況(±s)Tab.3 Each groups peripheral blood CD4 + CD25 +Foxp3 +T cells(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

圖1 流式細胞儀分析Fig.1 Flow cytomeric analysis

表4 各組血清雌三醇情況(±s)Tab.4 Each groups serum estriol(±s)

表4 各組血清雌三醇情況(±s)Tab.4 Each groups serum estriol(±s)

Note:1)with normal group comparison of P ＜0.05;2)with severe pre-eclampsia group comparison of P ＜0.05.

2.3 各組血清雌三醇情況 輕度子癇前期組和重度子癇前期組血清雌三醇分別為(6.16±2.17)mg/L 和(3.27±1.15)mg/L，明顯低于正常組的(11.34±2.4)mg/L，差異有統計學意義(P ＜0.05);輕度子癇前期組血清雌三醇高于重度子癇前期組(P ＜0.05)。見表4。

3 討論

妊娠期高血壓疾病在疾病早期，患者多無任何的不適，部分孕婦可有輕微的頭痛頭暈，血壓小幅度升高;病情較重者常見的臨床癥狀為頭痛，眼暈眼花，重度高血壓和蛋白尿。HDCP 孕婦的臨床檢查措施包括孕婦特殊檢查(眼底檢查、凝血功能和心肝腎等重要臟器功能檢查)和胎兒的檢查(胎兒發育狀況，胎兒宮內情況和臍動脈血運)，臨床上主要根據患者的病史、臨床癥狀和輔助檢查等綜合診斷該疾病。HDCP 治療的主要目的是為了避免病情進展到重度子癇前期和子癇，盡可能降低產婦和新生兒死亡，提高母嬰的生命安全。HDCP 的主要治療措施包括臥床休息，硫酸鎂解痙，選擇合理降壓藥降低血壓，利尿，根據患者的具體情況進行適度鎮靜，必要時可終止妊娠。

免疫耐受是胚胎成功生長發育的關鍵，其發生機制可能為人體內MHCⅠ類抗原分子的缺如和補體調節蛋白的表達和局部免疫抑制［3］。CD4+CD25+調節性T 細胞(Treg)在免疫耐受中發揮重要作用，它可保證內環境的穩定，抑制機體對異體物質的排斥和影響其他T 細胞的功能。據報道，CD4+CD25+調節性T 細胞在妊娠早期分泌逐漸增多，直至分娩后該細胞一直處于高水平［4］。本文發現正常孕婦組體內CD4+CD25+調節性T 細胞水平明顯高于妊娠高血壓孕婦，重度子癇前期組較輕度子癇前期組該細胞水平明顯降低，與相關報道結果一致［5］，說明CD4+CD25+調節性T 細胞參與HDCP的發病。

Foxp3 是一種轉錄因子，存在于細胞質內，調控著CD4+CD25+調節性T 細胞的功能。研究已證實［6］，Foxp3 的mRNA 和其轉錄反映的蛋白質特異性作用于CD4+CD25+調節性T 細胞。正常妊娠過程中CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞在妊娠早期明顯增加，中期稍微減弱，分娩后明顯減少，但妊娠期高血壓疾病可引起該細胞水平下降，病情越重其含量越低，重度子癇前期該細胞含量最低。本文結果論證了上述觀點，說明CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞參與妊娠高血壓疾病發生、發展的調節。

研究報道，采用雌激素進行體外刺激可增加Foxp3 的表達，可促進CD4+CD25+調節性T 細胞的增殖分裂，使其數量增多［7］。因此，人體內雌激素的水平對妊娠結局具有重要影響，它對妊娠過程中的免疫耐受也具有重要的作用。妊娠期間T 淋巴細胞發生明顯偏移，雌三醇可抑制該過程的發生，并促使T 淋巴細胞分化為Th2 型淋巴細胞，增強調節性T 細胞的活性，促進其功能［8］。本文重癥子癇輕度子癇前期組和重度子癇前期組CD4+CD25+Foxp3+T 細胞絕對數量和血清雌三醇濃度均明顯低于正常妊娠組，說明CD4+CD25+Foxp3+T 細胞數量減少和雌三醇低水平無法維持機體的免疫耐受狀態，可能造成病理性妊娠，如妊娠期高血壓疾病。

CD4+CD25+調節性T 細胞及相關的細胞因子在機體免疫系統中占有舉足輕重的地位，它們的主要功能是抑制機體的免疫活性，抑制機體對移植物的排斥作用。CD4+CD25+調節性T 細胞對自身免疫性疾病的治療具有廣闊的應用前景［9］。已有研究證實，調節性T 細胞用于自發性流產的實驗研究，具有很好的調節作用［10］。

總而言之，妊娠高血壓疾病患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞明顯減少，同時血清雌三醇也有所降低，這些可能與妊娠期高血壓疾病的發病機制以及免疫耐受有關。CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞在妊娠高血壓疾病的發病機制中占據重要地位，后續研究應進一步研究妊娠高血壓疾病的發病機制，為臨床防治提供理論依據。

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