Rab5a 促進(jìn)LPS 活化的巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)①

孫曉琳 謝基明 云小樂 張 威 康鴻斌 萬永青 劉竟然 鞏 培 趙世敏 王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

內(nèi)毒素(Endotoxin)是G-菌及其他微生物(立克次體，衣原體等)細(xì)胞壁外膜中的重要組成部分，它的化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可被TLR4 識(shí)別。TLR4 介導(dǎo)的LPS 誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括MyD88 依賴性和MyD88 非依賴性兩個(gè)途徑［1］。在與LPS 結(jié)合后，TLR4 招募接頭分子MyD88，激活I(lǐng)L-1 受體相關(guān)激酶(IRAK)所介導(dǎo)的NF-κB 和MAPK 通路，啟動(dòng)TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄及翻譯［2］。此外，MEK1/ERK1 途徑活化促使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，催化產(chǎn)生大量NO，參與內(nèi)毒素性大鼠的組織損傷過程［3］。

Rab 蛋白在GTP 結(jié)合的活性形式和GDP 結(jié)合的非活性形式之間轉(zhuǎn)換［4］，調(diào)控著囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［5］。Rab5a 參與了調(diào)控胞吞過程中胞吞泡與早期內(nèi)體的融合，是早期胞吞途徑中一個(gè)重要的限速成分。Rab5a 不但參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)分選，而且還與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架重建等功能密切相關(guān)。例如:Rab5 和Rab7 可與交叉提呈的MHCⅠ類分子肽復(fù)合物共聚。Rab5 參與表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);過表達(dá)失活突變的Rab5S34N 阻斷了通過EGFR 活化引起的Raf-ERK1/2 信號(hào)通路以及細(xì)胞的增殖［5］。

本實(shí)驗(yàn)以小鼠單核/巨噬細(xì)胞株RAW264.7 作為細(xì)胞模型，研究過表達(dá)Rab5a 對(duì)LPS 刺激的巨噬細(xì)胞中iNOS、TNF-α 和IL-6 表達(dá)的變化。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討Rab5a 在TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(購自北京協(xié)和細(xì)胞庫)，胎牛血清(購自蘭州民海生物有限公司)，DMEM 培養(yǎng)基(購自美國Gibco 公司)，MTT 和LPS (均為美國Sigma 公司產(chǎn)品)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq 酶，Real-Time PCR mix(均為寶生物公司產(chǎn)品)，Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen 公司)，iNOS 測(cè)定試劑盒(南京建成生物公司)，TRIZOL、G418(均為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品)。真核表達(dá)載體Rab5a 為本實(shí)驗(yàn)室保存。Rab5aN133I 質(zhì)粒是將Rab5a 蛋白第133 位的天冬酰胺(N)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，該突變表現(xiàn)為GTP 結(jié)合能力下降，因而稱為失活突變［6］。

1.2 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7 的培養(yǎng) RAW 264.7 細(xì)胞株混懸后接種于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d 換液或傳代一次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞計(jì)數(shù)，將RAW264.7 巨噬細(xì)胞(105個(gè)/孔)接種于6 孔板中，5%CO2、37°C 過夜培養(yǎng)。1 μg 真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab5a、pcDNA3.1/tRab5a)分別與3 μl Lipofectamine 2000 試劑混和，室溫作用20 min，以形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，隨即將復(fù)合物加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后4～6 h 換液。48 h 后加G418(800 μg/ml)作用3 周，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，采用Real-Time PCR 驗(yàn)證相應(yīng)的篩選結(jié)果。

1.4 Real-time PCR TRIZOL 法提取細(xì)胞的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA。以sence 5'-GAGCAACAAGACCCAACG-3' 和 antisence 5'-ATGATACCGTTCTTGACC-3'為Rab5a 的Real-Time PCR 引物。檢驗(yàn)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞株是否穩(wěn)定表達(dá)。Real-Time PCR 通過ABI 7300 (Applied Biosystems，USA)和the SYBR RTPCR kit 進(jìn)行分析。同樣方法檢測(cè)iNOS、TNF-α、IL-6 的表達(dá)情況，文中使用的引物序列見表1。

1.5 MTT 法測(cè)基因轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的影響細(xì)胞計(jì)數(shù)，將三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞以相同量(103個(gè)/每孔)接種與96 孔板，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。5～6 h 貼壁后血清饑餓12 h 開始計(jì)時(shí)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，到達(dá)時(shí)間點(diǎn)加入MTT(0.5 mg/ml)，37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h 后每孔加入150 ml DMSO，低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀用OD490 nm 檢測(cè)。

1.6 iNOS 含量測(cè)定 細(xì)胞計(jì)數(shù)，將三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞以相同量(105個(gè)/每孔)接種于24 孔板，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。LPS/Poly I:C 刺激6 h 和18 h，按照iNOS 測(cè)定試劑盒測(cè)定iNOS 含量。

1.7 細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 含量測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(R＆D)定量分析細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α 和IL-6 的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行分析，P＜0.05 時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)Rab5a 細(xì)胞系的鑒定 篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株后，我們通過Real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞株是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，結(jié)果如圖1 所示，Rab5a 過表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和Rab5a 突變過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Rab5a 表達(dá)量明顯大于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以上結(jié)果說明穩(wěn)定表達(dá)Rab5a 的細(xì)胞系已經(jīng)成功建立。

2.2 MTT 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì) 從MTT 測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖2)中可以看出，過表達(dá)Rab5a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞第2 天進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，而Rab5aN133I突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞第3 天開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，并且Rab5a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯高于Rab5aN133I 突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，Rab5a 的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列Tab.1 Primers used in experiment

2.3 LPS 刺激下iNOS 表達(dá)水平檢測(cè) 巨噬細(xì)胞受到LPS 刺激時(shí)，可激活細(xì)胞內(nèi)ERK 激酶，并促使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達(dá)，催化產(chǎn)生大量NO，NO 參與殺滅微生物并介導(dǎo)一系列免疫病理過 程［3］。我們通過Real-TimePCR對(duì)iNOS的mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)(圖3A)。又通過iNOS 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了iNOS 的蛋白分泌量(圖3B)。如圖所示，在LPS刺激后，穩(wěn)定表達(dá)Rab5a和Rab5aN113I 的細(xì)胞中iNOS 含量均隨刺激時(shí)間增加而增加。其中，過表達(dá)Rab5a 顯著促進(jìn)了LPS 介導(dǎo)iNOS 的生成。而Rab5aN113I 細(xì)胞中iNOS 的mRNA 與蛋白水平與對(duì)照組相比都沒有顯著增高。

2.4 Rab5a 促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 的表達(dá) NO 的過量生成與炎癥密切相關(guān)，TNF-α、IL-6、IL-1等都能活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)iNOS的表達(dá)，進(jìn)一步產(chǎn)生NO。我們隨后檢測(cè)了Rab5a對(duì)巨噬細(xì)胞中TNF-α 表達(dá)的影響。利用Real-Time-PCR 對(duì)TNF-α 的mRNA 水平進(jìn)行了檢測(cè)(圖4A)。采用ELISA 的方法檢測(cè)了TNF-α 的蛋白分泌量(圖4B)。結(jié)果表明 Rab5a 過表達(dá)顯著促進(jìn)了RAW264.7 細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 的生成。與穩(wěn)定表達(dá)Rab5a 的細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)Rab5aN113I的細(xì)胞中LPS 刺激產(chǎn)生的TNF-α 表達(dá)量顯著下降。

2.5 Rab5a 促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)的IL-6 的表達(dá) 同樣，通過Real-Time PCR 和ELISA 試劑盒對(duì)IL-6 的表達(dá)量分別從mRNA 水平和蛋白分泌量層面進(jìn)行了檢測(cè)(圖5A、B)。LPS 刺激2、8 和16 h，過表達(dá)Rab5a 細(xì)胞中IL-6 mRNA 水平均明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和失活突變細(xì)胞(圖5A)。通過ELISA 試劑盒檢測(cè)，LPS 刺激12 h 和24 h，過表達(dá)Rab5a 細(xì)胞上清中IL-6 明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和失活突變細(xì)胞(圖5B)。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Rab5a 的表達(dá)水平Fig.1 Detection of Rab5a expression in stable cell lines

圖2 MTT 法測(cè)定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.2 Determination of growth trends of stably transfected cells by MTT assay

圖3 LPS 刺激不同時(shí)間iNOS 表達(dá)測(cè)定Fig.3 Expression of iNOS after stimulation with LPS at different times

圖4 Rab5a 對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞中TNF-α 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Rab5a on LPS-induced TNF-α expression in RAW264.7 cells

圖5 Rab5a 對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞中IL-6 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Rab5a on LPS-induced IL-6 expression in RAW264.7 cells

3 討論

Rab5a 是Rabs 蛋白的一個(gè)成員，具有GTP 酶活性［7］，近年來，許多研究表明，Rab5a 不僅參與轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的運(yùn)輸過程，而且通過調(diào)控一些膜受體的轉(zhuǎn)運(yùn)間接調(diào)控受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］。我們成功建立了穩(wěn)定表達(dá)Rab5a 和Rab5aN113I 突變巨噬細(xì)胞系。有研究表明Rab5a 基因與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有關(guān)，Rab5a 對(duì)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響未見報(bào)道。從MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷Rab5a 基因過表達(dá)后，RAW264.7 的生長(zhǎng)速率明顯提高，據(jù)此推測(cè)Rab5a 促進(jìn)了RAW264.7 生長(zhǎng)。

NO 參與了體內(nèi)眾多生理、病理過程，包括免疫調(diào)節(jié)、松弛平滑肌、神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞毒作用等［9］，還能引起細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管生成［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用Real-Time PCR 的方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)了Rab5a 過表達(dá)細(xì)胞在LPS 刺激0、2、8、16 h 后iNOS mRNA 水平的變化。結(jié)果表明，在LPS 刺激后2 h，Rab5a 就開始促進(jìn)iNOS mRNA 的表達(dá)，這種促進(jìn)作用在6 h 達(dá)到高峰，16 h 后開始下降(圖3A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Rab5a 對(duì)LPS 刺激的巨噬細(xì)胞中iNOS 表達(dá)的調(diào)控，我們又采用了iNOS檢測(cè)試劑盒從蛋白水平檢測(cè)了iNOS 的表達(dá)變化。因?yàn)榈鞍椎谋磉_(dá)滯后于mRNA 的表達(dá)，我們選擇了LPS 刺激后6 和18 h 來驗(yàn)證iNOS mRNA 在LPS 刺激后2 和8 h 的表達(dá)。結(jié)果表明，Rab5a 也促進(jìn)了iNOS 蛋白的表達(dá)(圖3B)。

同樣的，我們檢測(cè)了Rab5a 過表達(dá)后LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞中TNF-α 和IL-6 的影響。從圖4A 可以看出，Rab5a 在LPS 刺激后2 h 就顯著地促進(jìn)了LPS 誘導(dǎo)的TNF-α mRNA 的表達(dá)，在8 h 達(dá)到高峰，16 h 稍有下降。我們想知道，Rab5a 的這種促進(jìn)作用是否持久，所以選擇了在12 h 和24 h 檢測(cè)TNF-α 的分泌水平。結(jié)果表明，在LPS 刺激后24 h，Rab5a 仍能促進(jìn)TNF-α 的表達(dá)(圖4B)。對(duì)IL-6的檢測(cè)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞中Rab5a 以時(shí)間依賴性的方式促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的IL-6 的表達(dá)(圖5)。細(xì)胞因子可以促進(jìn)iNOS 的表達(dá)，我們推測(cè)Rab5a 可能通過促進(jìn)TNF-α 和IL-6 的表達(dá)來促進(jìn)iNOS 的表達(dá)。

Rab 蛋白具有GTP 酶活性，能夠在GTP 結(jié)合的活性形式和GDP 結(jié)合的非活性形式之間轉(zhuǎn)換。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了GTP 酶活性缺失的Rab5a 突變體N133I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rab5a 失活突變基因的表達(dá)阻斷了Rab5a 對(duì)IL-6、TNF-α、iNOS 等炎性介質(zhì)的表達(dá)。該結(jié)果說明，Rab5a 發(fā)揮作用依賴其GTP 結(jié)合能力。有研究表明，Rabs 家族成員Rab7b 和Rab7參與TLRs 信號(hào)通路且負(fù)向調(diào)控NO 產(chǎn)生和TLRs 信號(hào)通路［11-14］，但是Rab5a 是否參與調(diào)控TLRs 的信號(hào)通路，并未見報(bào)道。我們的研究顯示，Rab5a 參與了LPS 誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。我們以前的研究表明，Rab7b 可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)TLR4 到溶酶體進(jìn)行降解，從而負(fù)向調(diào)控了TLR4 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。Rab5a促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)的是否通過其囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)功能來實(shí)現(xiàn)有待進(jìn)一步研究。

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