新型鴨呼腸孤病毒S組基因克隆及序列分析

卿柯香，袁遠華，郭霄峰，黃淑堅

根據國際病毒分類委員會第九次報告，正呼腸孤病毒屬依然分3 個亞群：第Ⅰ亞群包括不含融合基因的哺乳動物呼腸孤病毒（Mammalian reoviruses，MRV）；第Ⅱ亞群包括具有融合基因的禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）和內爾森海灣病毒（Nelson Bay virus，NBV）；第Ⅲ亞群包括狒狒呼腸孤病毒（Baboon reovirus，BRV）；從蛇分離到的兩株呼腸孤病毒暫且將其歸為第Ⅳ亞群[1-2]。其中禽呼腸孤病毒包含雞源、火雞源、鵝源、番鴨源的呼腸孤病毒。

新型鴨呼腸孤病毒（New-type duck reovirus，NDRV）病，是一種以肝臟不規則壞死、出血斑/點和心肌、腔上囊出血為主要特征的新疫病，各品種鴨（如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨等）均可感染發病。該病病原為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，一種分節段的dsRNA病毒[3]。NDRV含有10個RNA片段，即3 個大基因Ll、L2、L3，分別編碼λA、λB、λC3 種蛋白；3 個中基因M1、M2、M3，分別編碼μA、μB和μNS5 種蛋白；4 個小基因S1、S2、S3 和S4，分別編碼P10、P18、σC、σA、σB和σNS6 種蛋白[4]。

本實驗室從臨床病料分離到1 株新型鴨呼腸孤病毒，并命名為NDRV-QY 株[5]。為了解QY 株病毒與其他正呼腸孤病毒的遺傳進化關系，本試驗將QY 株的S組基因核苷酸序列與國內外參考毒株進行了比對和分析，以初步明確該株病毒的分類地位。

1 材料與方法

1.1 病毒株及工程菌 新型鴨呼腸孤病毒（NDRVQY）、工程菌大腸桿菌DH5α感受態細胞由佛山科學技術學院生命科學學院傳染病室提供。

1.2 主要試劑 RNAiso Reagent，購自美國Invitrogen 公司；反轉錄試劑盒、Premix ExTaqTMVersion2.0、pMD18-T 載體、DNAMarker（DL-2 000），均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（2000）為OMEGA公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.3 引物的設計與合成 參照GenBank 中登錄的NDRVS1、S2、S3 和S4 基因序列（JX478256、JF320803、GQ888710、GU338025），用Primer Primer5.0 軟件設計合成了覆蓋S1、S2、S3 和S4 基因開放閱讀框的多對特異性引物（見表1）。

表1 引物序列

1.4 病毒S組基因RT-PCR 擴增 按RNAiso Reagent 操作說明書提取病毒總RNA，隨機引物和AMV反轉錄后作為模板，采用見表1 中引物進行PCR 擴增。PCR 反應條件為：94 ℃4 min；94 ℃50 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min 20 s；進行30 個循環，最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠純化與回收PCR 產物，連接至pMD18-T 載體中，轉化E.coliDH5α感受態細胞，鋪氨芐抗性LB瓊脂平板37 ℃倒置培養，經鑒定后挑取陽性菌落進行擴大培養，送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.5 S組基因核苷酸及其推導氨基酸序列分析利用DNAStar（Version 7.10）軟件對測定的病毒核苷酸序列及其推導氨基酸序列與GenBank 中收錄的正呼腸孤病毒屬成員的核苷酸和推導氨基酸的序列進行同源性比對和分析。

2 結果

2.1 S1、S2、S3 基因和S4 基因的RT-PCR 擴增結果 利用S組各段基因特異性引物進行RT-PCR擴增，結果與預期相符。利用DNAStar 軟件進行序列拼接，QY 株S1、S2、S3 基因和S4 基因核苷酸編碼區序列已登錄在GenBank 中，登錄號分別為：KF689545、JQ863359、JQ866923、JQ922269。

2.2 S組基因編碼區cDNA核苷酸序列和推導氨基酸序列的比較分析 S1 基因為多順反子，編碼區全長1 517bp，3 個部分重疊開放性閱讀框（ORF）分別編碼p10 蛋 白（ORF 為294，編 碼97aa），功能未知的p18 蛋白（ORF 為489 bp，編碼162aa）和σC蛋白（ORF 為966 bp，編碼321aa）。DRV-QY 株σC蛋白編碼區核苷酸序列與DRV的相似性為95.5%～97.5%，與MDRV的相似性為51.3%～52.3%，與ARV的相似性只有39.4%～40.9%。氨基酸序列相似性顯示，DRV-QY 株與DRV的氨基酸序列相似性為96.0%～97.2%，與MDRV的相似性為42.6%～43.0%，與ARV的相似性為27.0%～29.9%。

S2 基因ORF 全長1 251 bp，編碼由416 個氨基酸組成的σA蛋白。DRV-QY 株σA蛋白編碼區核苷酸序列與DRV的相似性為88.1%～99.5%，與MDRV的相似性為85.8%～91.2%，與ARV的相似性為73.3%～74.8%。

S3 基因ORF 全長1 104 bp，編碼由367 個氨基酸組成的σB蛋白。和氨基酸序列相似性分析表明，DRV-QY 株σB蛋白編碼區核苷酸序列與DRV的相似性為96.6%～98.6%，與MDRV的相似性為66.5%～66.8%，與ARV和TRV的相似性為64.7%～67.6%。氨基酸序列相似性顯示，DRVQY 株與DRV的氨基酸序列相似性為94.8%～98.4%，與MDRV的相似性為68.1%～68.9%，與ARV和TRV的相似性為67.0%～69.2%。

S4 基因ORF 全長1 104 bp，編碼由367 個氨基酸組成的σNS蛋白。DRV-QY 株σNS蛋白編碼區核苷酸序列與DRV的相似性為92.9%～99.2%，與MDRV的相似性為83.9%～85.0%，與ARV和TRV的相似性為76.6%～79.1%。

2.3 QY 株與其他正呼腸孤病毒的遺傳進化關系QY 分離株S組核苷酸序列遺傳進化分析表明，參比序列大致分為3 個亞群，即哺乳動物呼腸孤病毒（MRV）亞群，狒狒呼腸孤病毒（BRV）亞群及禽呼腸孤病毒（ARV）和內爾森海灣病毒（NBV）亞群。其中DRV、ARV、TRV、MDRV、NRV位于第二亞群，且NDRV-QY 與新近報道的新型鴨呼腸孤病毒DRV處于進化樹的同一小分支，親緣性較近（見圖1）。

3 分析與討論

本研究參考新型鴨呼腸孤病毒的S組基因序列設計特異性引物，對國內分離株NDRV-QY 的S組基因編碼區進行RT-PCR 擴增、克隆及序列測定，表明QY 株S組基因片段所包含的主要ORF 大小分別為1 517 bp、1 251 bp、1 104 bp 和1 104 bp。

圖1 基因σC、σA、σB和σNS的遺傳發育樹

各序列分析結果表明，QY 株的S組基因各節段編碼區和GenBank中已有的ARV、TRV、MDRV、DRV、GRV均有不同程度的同源性，其中與DRV的同源性最高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性均達90%以上，與NBV、BRV、MRV同源性則為9.3%～59.4%，同源性較低。另外，QY 株與DRV、ARV、NBV、MRV的外殼蛋白，σC蛋白是由S1 基因編碼[4，6，7]，而MDRV的σC蛋白則是由S4 基因編碼的[8]。MDRV的S4 基因為多順反子，但是QY 株和DRV、ARV、NBV的Sl基因包含3個開放閱讀框（ORF）[4-11]。MDRV的S4基因缺少QY 株S1 的ORF2，不能表達p18 蛋白。以上結果表明，QY 株是有別于MDRV和ARV的新型鴨呼腸孤病毒，同時也說明我國家禽尤其是水禽體內存在著多種基因類群的呼腸孤病毒。

根據QY 株σC、σA、σB和σNS的遺傳進化樹分析表明，QY 株與DRV、MDRV、ARV同在正呼腸孤病毒的第Ⅱ亞群，是不同于MDRV和ARV的獨立分支。QY 株與DRV具有很高的同源性且處在同一個分支，提示它們可能來自同一祖先。

由上述結果分析可知，NDRV與MDRV、ARV可能具有相同的祖先而進化成不同的分支，建議將NDRV歸屬為正呼腸孤病毒屬的第Ⅱ亞群中。

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