犬瘟熱病毒感染病例的診斷與病毒分離鑒定

黃文明，沈明華

（1.青海省海南州同德縣畜牧獸醫工作站，青海 同德813200 ；2.青海大學畜牧獸醫學院，青海 西寧 810016）

犬瘟熱（Canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一種傳染性極強的急性、病毒性傳染病，宿主范圍較廣泛，能夠使犬、貂、貉、狐、熊、小熊貓、大熊貓、狼、獅、虎、金貓、猞猁等多種動物發生自然感染和發病。CDV在我國犬中的發病率和致死率都很高，寵物犬一旦感染后發病率可達100 %，死亡率也高達80 %，許多經濟動物如水貂等一旦感染發病也會給養殖場帶來嚴重的經濟損失[1-2]。近年來國內不斷有犬瘟熱病毒感染發病的報道，應引起對該病毒的重視，加快相應新型疫苗與診斷試劑的研究。本研究對臨床上1 例發病犬進行臨床和實驗室診斷，并分離到了病毒，最后確診發病犬感染了犬瘟熱病毒，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 取臨床發病的分泌物和排泄物進行相關診斷；犬瘟熱抗原快速檢測卡，購自深圳市康百得生物科技有限公司；一步法RT-PCR檢測試劑盒、DL-2 000 DNAMarker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 臨床癥狀 發病犬2 月齡，臨床可見眼結膜潮紅，分泌物多，有眼屎。精神沉郁，臥地不愿走動，發熱，體溫高達41.5 ℃，吃食減少，便血，未進行過犬瘟熱疫苗的免疫接種，根據臨床癥狀初步懷疑為犬瘟熱病毒感染。

1.3 鏡檢 取病犬的分泌物和排泄物，涂片、染色、做美藍和革蘭染色電鏡鏡檢。

1.4 試紙條檢測 利用商品化的犬瘟熱病毒檢測試紙條進行檢測。用干凈的棉簽蘸取病犬的分泌物和排泄物，放到專用稀釋液中充分攪拌，用吸管吸取上清液，在試紙條樣品孔正中滴加1滴吸液，10 min 后，觀察結果。

1.5 RT-PCR 檢測 根據參考文獻[3]合成犬瘟熱病毒檢測引物，提取病犬的分泌物和排泄物的病毒基因組，按照參考文獻[3]的RT-PCR 反應條件進行擴增，RT-PCR 擴增產物經核酸電泳觀察結果。

1.6 病毒的分離培養 將1.4 中病犬的分泌物和排泄物稀釋液用0.45 μm 的濾器過濾除菌作為病毒液，接種單層非洲綠猴腎細胞系（Vero）貼壁細胞，37 ℃作用1 h 后，加入含2 %新生牛血清的DMEM維持液培養基，置37 ℃培養箱中培養，每天觀察細胞病變，當出現70 %～80 %細胞病變時收獲病毒，盲傳3 代，凍存備用。

1.7 分離毒株血凝價測定 96 孔V型板第一排的12 個孔中依次加入生理鹽水25 μL，取第3 代分離毒株25 μL 加入第一孔，混合后取25 μL 加入第二孔，依次稀釋到第11 個孔，即211稀釋，第12 孔作為空白對照，取25 μL 1 %雞紅細胞加入上面孔中，37 ℃放置1 h，觀察血凝試驗結果。

1.8 分離毒株毒價測定 用96 孔微量細胞培養板測定細胞半數感染量（TCID50），將分離毒株做10-1～10-10倍梯度稀釋，分別接種96 孔細胞培養板培養的Vero 細胞，每個稀釋度接種8 個孔，0.1 mL/孔，置5 % CO2培養箱37 ℃培養7 d，逐日觀察記錄細胞病變情況，根據Reed-Munch 法計算TCID50。

1.9 分離毒株RT-PCR 檢測 按照1.5 的方法對第3 代分離毒株進行RT-PCR 檢測。

1.10 分離毒株的中和試驗 將第3 代分離毒株與等量抗犬瘟熱病毒特異性血清混合均勻后，置4 ℃中和反應過夜，次日接種單層Vero 貼壁細胞，觀察細胞病變情況，同時設不接種和接種第3 代分離毒株分別作為陰性對照和陽性對照。

2 結果

2.1 鏡檢結果 病犬的分泌物和排泄物鏡檢未見任何致病菌。

2.2 試紙條檢測結果 如圖1 所示，試紙條檢測線的位置出現清晰可見的條帶，表明試紙條檢測犬瘟熱病毒陽性。

圖1 試紙條檢測結果

2.3 臨床樣品RT-PCR 檢測結果 如圖2 所示，RT-PCR 擴增產物經核酸電泳顯示在242 bp 的位置具有特異性的擴增條帶，與郭玲等[3]的報道相一致，RT-PCR 檢測犬瘟熱病毒陽性。

圖2 R T-PCR 擴增結果

2.4 病毒的分離培養結果 如圖3 所示，病毒液接種72 h 后開始出現細胞病變，細胞出現變小、圓縮，細胞顆粒增多，許多細胞融合聚集呈多核巨細胞，部分細胞壞死脫落，而未接毒的Vero 細胞無變化。

圖3 正常Vero細胞和接毒病變細胞

2.5 分離毒株血凝試驗（HA）結果 觀察血凝試驗結果可見血凝板的1～8 個孔出現肉眼可見的紅細胞凝集，該病毒可以凝集1 %雞紅細胞，與犬瘟熱病毒能與雞、豚鼠等紅細胞發生不規律的凝集反應特性相符。

2.6 分離毒株毒價測定結果 按Reed-Muench 法測定分離毒株的TCID50為10-4.25/0.1 mL。

2.7 分離毒株RT-PCR 檢測結果 第3 代分離毒株RT-PCR 檢測結果為陽性。

2.8 分離毒株中和試驗結果 分離毒株與犬瘟熱病毒陽性血清中和反應后接種的Vero 細胞未見任何細胞病變，表明分離毒株可被犬瘟熱病毒陽性血清所特異性中和。

3 討論

發生犬瘟熱病毒感染后，應該盡早診斷并采取對癥治療措施，治療原則是加強機體免疫力，同時采取抗菌消炎方法防止繼發感染發生。故對疫病的準確診斷至關重要，隨著CDV研究的深入，RTPCR、熒光定量RT-PCR、RT-LAMP、ELISA、膠體金等各種技術不斷應用到CDV的檢測中，本研究根據自身試驗條件分別選擇了膠體金免疫學檢測技術和RT-PCR分子生物學檢測方法對臨床診斷疑似CDV感染的病例進行了檢測，經后續的病毒分離鑒定證實此次診斷結果準確、可靠。對CDV的分離培養，接種細胞的選擇至關重要，魏風等[4]研究表明，CDV能在多種細胞上生長，但在Vero 細胞上病變最明顯，毒價最高。故本研究選擇Vero 細胞作為了CDV的分離培養細胞，取得了良好的試驗結果，分離的毒株TCID50達10-4.25/0.1 mL，經細胞病變觀察、血凝試驗、中和試驗、RT-PCR 鑒定分離株病毒為CDV。

隨著我國特種經濟動物養殖業和寵物業的不斷發展，CDV的發病率一直居高不下，加強CDV診斷與流行病學方面研究工作，了解不同地區CDV的流行情況，對預防和控制犬瘟熱病毒感染具有重要意義。該病的診斷就是要盡可能做到早診斷，早治療，加大疾病治愈的幾率。要控制和消滅CDV，應該加強該病毒的免疫接種，臨床上好些病例都是由于未進行疫苗免疫接種導致，由于該病的傳播迅速，易感動物種類繁多，給該病的綜合防控提出很高要求。本試驗分離鑒定了1 株CDV病毒，豐富了我國地方毒株資源，為疾病的相關診斷和防治提供參考，也為本實驗室進行犬瘟熱疫苗與診斷試劑的研究奠定了基礎。

[1]李鑫，楊霞.菏澤市犬瘟熱發病調查[J].黑龍江農業科學，2014（4）：68-70.

[2]呂九云，張彥龍.1 株貉源犬瘟熱病毒的分離鑒定[J].中國獸醫雜志，2013，49（6）：26-29.

[3]郭玲，萬莉，馬磊，等.犬瘟熱病毒RT-PCR 檢測方法的建立[J].中國獸醫科學，2012，42（2）：60-64.

[4]魏鳳，管宇，王金良，等.犬瘟熱病毒在不同組織細胞上增殖特性的研究[J].動物醫學進展，2010，31（2）：83-86.