鹽酸吸入聯(lián)合機械通氣建立暴喘癥大鼠模型

黃小紅，黃紅坤，孫 俠，劉盛來，許惠英，唐小江

（廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣東 佛山 528248）

急性呼吸窘迫綜合征（暴喘癥）病因復雜，胃內(nèi)容物誤吸是臨床常見病因之一，其發(fā)病率逐年升高，死亡率高達40%左右。事實上，對暴喘癥的很多研究都是在動物急性肺損傷模型上進行的。根據(jù)致病因素研制模型，再根據(jù)模型研究其病理生理變化過程并擬定治療方案[1]。因此，模擬臨床常見病因建立相應的動物模型具有非常重要的意義。目前建立理想的誤吸所致暴喘癥動物模型是研究得以深入的關鍵。以往主要通過單純鹽酸吸入、鹽酸酸化后人乳滴入等方式制備該動物模型，損傷局限于肺部，難以造成呼吸窘迫程度。本研究模擬臨床誤吸病因，采用鹽酸吸入，同時聯(lián)合機械通氣的方法，使動物出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，為進一步開展誤吸造成的暴喘癥研究提供工作平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD大鼠，30 只，雄性，8～10周齡，體重300～350 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證明編號：4407208423。實驗動物的使用經(jīng)本中心實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 飼養(yǎng)條件 大鼠飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF 級動物房，實驗動物使用許可證號SYXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)溫濕度為20 ℃～26 ℃、40%～70%，采用10 h：14 晝夜間斷照明。喂以大鼠維持飼料（來自廣東省醫(yī)學實驗動物中心），自由進食飲水。

1.3 儀器與試劑 HX-300S動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司，LXJ-2B離心機，上海安亭科學儀器廠，CX21 生物顯微鏡，日本奧林巴斯廠，RM2135 輪轉(zhuǎn)切片機，德國LEICA公司，RS-18 生物組織全自動染色機，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司，BX41 病理圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯廠，濃鹽酸，批號20110901，廣州化學試劑二廠生產(chǎn)。

1.4 試驗方法 將檢疫合格的30 只SD大鼠按體重隨機分為正常對照組、小通氣量模型組、大通氣量模型組，10 只/組。（1）除正常對照組外，大鼠用2%戊巴比妥鈉按60 mg/kg 體重腹腔注射麻醉后，75%酒精消毒剃毛部位，手術依次剪開皮膚，分離暴露氣管。接著，向氣管注入0.1 mol/L 鹽酸；（2）隨后進行氣管插管，連接呼吸機通氣（小通氣量模型組通氣量為6 mL/kg 體重，大通氣量模型組通氣量為15 mL/kg 體重）；（3）連續(xù)通氣6 h后放血處死大鼠，剖檢取左右肺組織。

指標檢測：（1）右上肺組織進行肺泡灌洗，所得肺泡灌洗液（BALF）4 ℃1 000 r/min 離心10 min，去上清后，無菌生理鹽水重懸，細胞涂片并進行瑞氏染色，用血細胞計數(shù)器進行細胞分類計數(shù)灌洗液嗜中性粒細胞占白細胞分類百分比；（2）對左肺組織計算左肺組織濕干重比：置于60 ℃干燥箱中連續(xù)干燥48 h。左肺肺組織濕干重比=左肺肺組織干燥前重量/干燥后重量，即為左肺含水量；（3）組織病理學檢查：右肺4%多聚甲醛固定后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片，H.E.染色、封片，顯微鏡下閱片進行組織病理學檢查。

1.5 統(tǒng)計分析 各檢測指標數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差表示（X±s），采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件方差分析、秩和檢驗等統(tǒng)計方法進行組間差異的顯著性檢驗。

2 結果

2.1 動物觀察 造模后，小通氣量模型組大鼠呼吸頻率加快，出現(xiàn)輕度呼吸窘迫癥狀，大通氣量模型組大鼠呼吸頻率加快，出現(xiàn)中重度呼吸窘迫癥狀，口唇及指端發(fā)紺；正常對照組大鼠無異常。

2.2 左肺組織濕干重比 與正常對照組比較，小通氣量模型組、大通氣量模型組大鼠左肺組織濕干重比顯著高于正常對照組（P＜0.05、P＜0.01），見表1。

2.3 肺泡灌洗液嗜中性粒細胞占白細胞比例

表1 大鼠左肺組織濕干重比及肺泡灌洗液嗜中性粒細胞占白細胞比例結果

與正常對照組比較，小通氣量模型組、大通氣量模型組大鼠肺BALF 液嗜中性粒細胞占白細胞比例顯著高于正常對照組（P＜0.01），見表1。

2.4 肺部組織病理學觀察 剖檢大鼠，正常對照組大鼠正常對照組肺臟表面光滑、無出血點、質(zhì)軟。小通氣量模型組大鼠肺臟點狀出血或小片狀出血、質(zhì)軟。大通氣量模型組大鼠肺臟黑褐色或鮮紅色、腫大、大片狀出血或全肺出血。光鏡下200 倍所見如中插彩版圖1。

3 討論

暴喘癥病因復雜，有100 多種疾病可并發(fā)暴喘癥，但大致可分為直接原因和間接原因兩大類，分別為肺源性暴喘癥和肺外源性暴喘癥。據(jù)此，動物模型亦可分為肺內(nèi)型和肺外型。其中肺內(nèi)型包括鹽酸吸入型，從氣管內(nèi)注入0.1 mL 鹽酸（1 mL/kg）可使麻醉后動物發(fā)生ALI（急性肺損傷）。鹽酸吸入肺模型常被用作吸入性肺炎的試驗研究，研究表明[2-3]，向家兔氣管注入鹽酸后，引起肺泡-毛細血管膜損傷。鹽酸也可損傷PS（肺表面活性物質(zhì)）系統(tǒng)，出現(xiàn)暴喘癥的臨床特征。實際上，此種模型雖然循環(huán)功能穩(wěn)定，但組織損傷基本局限于肺部，是對胃內(nèi)容物的誤吸所致ALI 的模擬，而不足于切實形成暴喘癥模型。Hare 等（1999）給兔氣管內(nèi)分別滴入人乳、鹽酸酸化后的人乳建立了ALI 模型，與單純鹽酸吸入所致的ALI 模型比較，在炎性介質(zhì)、病理改變等方面無明顯差別。另一種肺內(nèi)型為機械通氣相關肺損傷，用20 mL/kg 的潮氣量、85 次/min 的呼吸頻率，2 h 可誘發(fā)大鼠的肺損傷[4]。其致病機制在于肺組織的過度膨脹造成的血管透壁壓和滲透性增加，大致包括加劇炎性反應、促進細胞凋亡、改變腎性細胞核苷酸和嘌呤受體的表達幾個方面，焦點在于是否有炎性因子參與肺損傷及參與的程度[5]。總之，機械通氣導致的血流動力學及神經(jīng)體液系統(tǒng)的改變在暴喘癥的發(fā)生中起著重要作用。目前另有報道[6]說明機械通氣是治療暴喘癥的重要手段，目前常采用低潮氣量（6 mL/kg）的機械通氣模式，已有多項研究表明可能更加有利于暴喘癥患者的恢復。因此，采用機械通氣用于動物模型的制備時，準確把握機械潮氣量是重點和難點。

在臨床上，誤吸導致急性肺損傷的影響因素甚多，形成機制比較復雜。鹽酸作為一種強酸性化學物質(zhì)，對肺可產(chǎn)生直接的損害，使肺泡上皮和肺毛細血管通透性增加，發(fā)生出血、壞死、淤血等病理改變，可作為對胃內(nèi)容物的誤吸所致暴喘癥的模擬[7]。

綜上所述，本研究成功建立了誤吸造成的暴喘癥大鼠模型。將鹽酸作為造模藥模擬臨床胃內(nèi)容物誤吸造成的暴喘癥，同時聯(lián)合機械通氣，使動物出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，改變以往主要通過單純鹽酸吸入、鹽酸酸化后人乳滴入等方式制備誤吸的急性肺損傷模型，損傷局限于肺部，難以造成呼吸窘迫程度的情況，更具可行性和穩(wěn)定性，從而涉及更廣范圍的誤吸病人，也更接近于臨床實際，通過成功建立誤吸造成的暴喘癥大鼠模型，為進一步開展誤吸造成的暴喘癥研究提供工作平臺。

[1]張麗榮，孫德峰，齊巖，等.ARDS動物模型介紹[J].國外醫(yī)學，2004，10.25（5）.

[2]Eijking E P，Commers D，So K L，et al.Surfactant Trea-tment of Respiratory Failure Induced by Hydrochloric Acid Aspiration in Rats[J].Anesthesiology，1993，78（6-）：1145-1149.

[3]Eijking E P，Commers D，So K L，et al.Prevention of Respiratory Failure After Hydrochloric Acid Aspiration by Intratracheal Surfactant Instillation in Rats[J].Anesth Analg，1993，76（3）：472-477.

[4]李新甫，汪建新.急性肺損傷動物模型研究進展[J].國外醫(yī)學呼吸系統(tǒng)分冊，2005，25（7）：506-508.

[5]楊錢華，嚴玉澄.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征相關性急性腎損傷的研究進展[J].上海醫(yī)學，2009，32（9）：830-833.

[6]張凌，付平.ARDS合并AKI 的診治進展[J].中國血液凈化，2010，9（3）：117-119.

[7]牛永勝，穆心葦，張少華.誤吸性肺損傷發(fā)病機理[J].臨床麻醉學雜志，2004，20（11）：699-700.