牛源麥氏弧菌的分離鑒定及進化分析

方志超 ，羅梓桐，黃 攀，刀麗梅，單文杰，林 雅，范財良，程方俊

（1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌402460 ；2.重慶市榮昌縣畜牧局，重慶榮昌 402460）

麥氏弧菌（Vibrio metschnikovii）又稱梅氏弧菌，是廣泛存在自然界的致病性弧菌，也是國內外公認的致病性弧菌。主要存在于海水，河水，水產品和食品中。近年來，已從水源，牛糞便、雞肝、蒼蠅中分離出該菌[1-2]。V.metschnikovii可引起人類傷口感染、食物中毒、腹瀉和敗血癥，是公共衛生學上重要的病原微生物。姜淑紅等[3-5]人都曾報道過麥氏弧菌引起人腹瀉，沈強[6]報道，從食物中檢測出麥氏弧菌，并引起人的食物中毒。Hansen[7]等人報道麥氏弧菌導致敗血癥，呼吸道感染，傷口感染。在動物方面，樸范澤[8]報道雛雞感染V.metschnikovii后出現突然發病、腹瀉以及嚴重腸炎，死亡率高。楊瑛等[9]發現，V.metschnikovii與豬鏈球菌2 型具有較強的協同致病作用，可引起豬的死亡。

16SrRNA基因普遍存在于原核生物中，不同細菌具有非常相似的保守區又具有其特異性可變區。16SrRNA長約1 500 bp，便于測序和序列分析，因而它非常適合對細菌進行鑒定和系統進化關系研究，已經被越來越多的學者接受[10]。本試驗通過傳統細菌學鑒定和16SrRNA序列分析方法鑒定從牛上呼吸道分離出的3 株細菌，同時進行系統進化分析，了解其進化關系。動物致病性試驗、藥物敏感性篩選為今后進一步研究該菌致病情況、耐藥性以及指導臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 用無菌棉簽采集重慶、四川某牛場肉牛的鼻腔黏液，放入已滅菌的LB營養肉湯中，4 ℃保存，備用。

1.2 試驗動物 健康家兔，20 日齡健康小鼠。

1.3 主要試劑和材料 實驗室常規用品由西南大學榮昌校區預防獸醫教研室提供；微量生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒、PCR 產物凝膠回收試劑盒，均購自廣州飛揚生物技術公司；Mix DL-2 000 Marker、6×Loading Buffer、PCR 試劑盒Premix ExTaq、無菌雙蒸水，均購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 引物 參考細菌16SrRNA通用引物（正向：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′），由上海百力格有限公司合成。

1.5 病原分離 將樣品接種到鮮血瓊脂培養基，置于37 ℃恒溫箱培養24 h，取單個菌落進一步純化，經純化的單個菌落保存于鮮血瓊脂斜面，4 ℃保存備用。

1.6 培養特性及形態學觀察 將分離菌株接種于TCBS培養基，置于37 ℃恒溫箱培養24 h，觀察細菌的生長情況及菌落特征。挑取培養基上單個菌落涂片，進行革蘭染色，然后鏡檢。

1.7 生化試驗 將分離菌株分別進行糖發酵試驗（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、吲哚試驗、V-P 試驗、M.R.試驗、硫化氫試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、氧化酶試驗、硝酸鹽試驗，置于37 ℃恒溫箱培養24 h～48 h，觀察并記錄結果。

1.8 16SrRNA基因的擴增及測序 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 經30 個循環；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，結果照相保存。PCR 產物按照PCR 產物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，回收產物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.9 同源性分析和系統進化分析 將分離菌株的16SrRNA基因序列通過NCBI 的Blast 檢索系統進行同源性分析，并使用DNAStar 軟件與從Gen-Bank 數據庫中獲得的16SrRNA基因序列構建系統進化樹。

1.10 藥敏試驗 藥敏試驗按照CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）推薦的K-B法進行，判定標準參照美國實驗標準委員會（NCCLS）藥敏紙片擴散法規標準。

1.11 致病性試驗 將該分離菌株DF309-1 于馬丁肉湯中靜置培養18 h，0.2 mL（8.7×108CFU/mL）劑量小鼠腹腔注射。并設立對照組，觀察并記錄小鼠的生理狀況。

2 結果

2.1 培養特性及形態學觀察 分離出3 株細菌分別命名為FD39-1、ZC3、ZC4。分離菌株在鮮血培養基中呈圓形、光滑、凸起的中等菌落，具有β-溶血現象。在TCBS培養基中呈黃色菌落，經革蘭染色為革蘭陰性彎曲桿菌。3 株分離菌株的生化特征見表1。

表1 分離菌株生化特征

2.2 16SrRNA基因的擴增 經16SrRNA基因擴增，擴得的凝膠電泳片段與目的片段大小一致（如圖1）。

圖1 分離菌株的擴增結果

2.3 同源性分析與進化樹構建 將3 株分離菌的16SrRNA序列分別通過Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比較，菌株FD39-1 與9株V.metschnikovii的相似性最高，為99%；菌株ZC3、ZC4 與18 株V.metschnikovii的相似性最高，為95%～96%。

選取GenBank 上登錄的V.metschnikovii 的16SrRNA序列，利用DNAStar 軟件分析，與3 株分離菌株進行系統進化樹構建（如圖2）；ZC3 與ZC4 位于同一分支，與印度分離株HQ658055.1、山東青島分離株JX409930.1 進化關系較近，但與FD39-1 進化關系較遠，雖然都屬于V.metschnikovii，但不是同一個進化分支。菌株FD39-1 與韓國分離株KC634073.1（Vibrio sp.M12-1144）進化關系較近。

2.4 藥敏試驗結果 見表2。

2.5 致病性試驗結果 接種FD39-1 菌株的小鼠主要表現為精神委頓，豎毛，活動減少，食欲下降，腹瀉，24 h 全部死亡，剖檢小鼠可見腸絨毛脫落，腸壁化膿性炎癥。取腸內容物均分離出該菌。對照組精神狀況良好，飼養1 周無死亡。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

本試驗從肉牛上呼吸道分離到的3 株細菌在鮮血平板具有β-溶血現象，在TCBS培養基長出黃色菌落，各項生化結果均與已報道的V.metschnikovii生化特性一致[1，11]；分子鑒定采用16SrRNA基因鑒定方法，結果顯示，3 株分離菌株FD39-1、ZC3、ZC4 的16SrRNA序列與V.metschnikovii的16SrRNA序列同源性分別為99.6%、95.9%、96.4%。結合培養形態特征和生化特征，可鑒定3株分離菌株為V.metschnikovii。利用DANStar 構建進化樹，顯示ZC3與ZC4進化關系很近，與FD39-1 的進化關系較遠，不在同一個進化分支，這是由于ZC3、ZC4 菌株來源于四川某牛場，而FD39-1 菌株來源于重慶某肉牛場，不同地區V.metschnikovii的進化有所差異。ZC3 與ZC4 同印度分離株HQ658055.1、山東青島分離株JX409930.1 進化關系較近，屬于同一族。菌株FD39-1與韓國分離株KC634073.1 進化關系較近，位于第二族。

劉利芝[11]等人對V.metschnikovii耐藥狀況研究發現，對丁胺卡那霉素、羥氨芐青霉素和克拉維酸、氨芐西林和舒巴坦、先鋒V、頭孢替坦、慶大霉素、四環素敏感；對氨芐青霉素、先鋒必、頭孢噻肟、復達欣、環丙沙星、妥布霉素耐藥；對哌拉西林中度敏感。李正義等[12]研究發現，V.metschnikovii對青霉素有耐藥性，對氨舒鈉和頭孢唑啉中度敏感，對頭孢替坦、頭孢他定、頭孢曲松、阿米卡星、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星和磺胺甲惡唑/甲氧芐啶敏感。本試驗藥敏試驗結果顯示，菌株ZC3、ZC4 僅對頭孢曲松、洛美沙星、頭孢拉定敏感，環丙氟哌酸、青霉素等大多數藥物耐藥，耐藥性較為嚴重；菌株FD39-1 對先鋒霉素V、頭孢曲松、洛美沙星、紅霉素敏感，對青霉素、林克霉素耐藥，這與李正義、王欽升報道一致。分析認為菌株ZC3、ZC4 來源于四川散養戶，可能由于抗生素濫用導致細菌耐藥性較為嚴重，FD39-1 來源于重慶某集約化牛場，管理規范，用藥合理，因此沒有嚴重的耐藥性。

本試驗中，采用小鼠進行致病性試驗，孫延釜[2]、張曉玫[4]、劉利芝[11]等人在研究V.metschnikovii毒力試驗中均采用小鼠作為試驗動物，致病性試驗中，接種FD39-1 菌株的小鼠先后發病，主要表現為精神委頓，豎毛，活動減少，飲食下降，腹瀉，24 h 全部死亡，這與孫延釜[3]、劉利芝[11]等人的致病性試驗結果一致，說明菌株FD39-1 有很強的致病力。

麥氏弧菌（V.metschnikovii）主要存在于水產品以及食物中，是一種致病性弧菌，易引起食物中毒。本試驗采用傳統細菌學鑒定方法和16SrRNA序列分析方法首次從肉牛上呼吸道分離并鑒定出3 株V.metschnikovii，證實V.metschnikovii存在于肉牛上呼吸道，可能肉牛上呼吸道潛在性病原，并可能成為食源性病原菌來源之一。因此對于V.metschnikovii的研究，不僅進一步研究V.metschnikovii成為肉牛上呼吸道感染潛在性病原奠定基礎，在食品安全，公共衛生方面也有重要意義。

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