犬瘟熱病毒疫苗株與野毒株H 蛋白球狀頭部域的免疫原性比較研究

秦曉冰 ，王怡男，張傳美，黃 娟，張洪亮，王 聰，胡琳琳，單 虎

（1.青島農業大學動物科技學院 山東省預防獸醫學重點實驗室，山東 青島 266109；2.山東省安丘市畜牧局，山東 安丘 262100）

犬瘟熱（Canine Distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus，CDV）感染引起的犬科、鼬科和其他食肉目動物的急性或亞急性、高度接觸致死性傳染病，對當前養犬業、特種經濟動物養殖業和野生動物保護業危害巨大。血凝素（H）蛋白是CDV囊膜表面糖蛋白纖突，與病毒吸附、融合并侵入宿主細胞直接相關[1]。H 蛋白是CDV誘導機體產生中和抗體的主要抗原。H 蛋白的中和抗原表位編碼的多肽可刺激機體產生中和抗體，中和CDV的傳染性。但在犬瘟熱病毒感染宿主過程中，不同毒株H 蛋白主要抗原表位區球狀頭部域（Head Domain）的中和抗原表位變化是否會對毒株間抗原演變或體液免疫機制產生影響尚不清楚。為此，本研究構建了疫苗株和野毒株Head Domain 基因的原核表達載體，并在表達宿主菌中成功表達，為進一步研究H 蛋白中和抗原表位及其體液免疫機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 疫苗株CDV3、Asia-Ⅰ型野毒株組織毒LYM、Vero 細胞和pET-30a 質粒均由本實驗室保存；E.coliDH5a、BL21（DE3），均購自寶生物工程（大連）有限公司；6 周齡昆明系小鼠，購自青島派特福德小鼠養殖專業合作社。

1.2 主要試劑 TRIZol LS?Reagent RNA提取試劑盒，購自Invitrogen 公司；ExTaq/PrimeSTAR HSDNA聚合酶、限制性內切酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司；兔抗His 標簽單克隆抗體，購自北京普利來基因技術有限公司。

1.3 引物設計與合成 根據CDV-H基因擴增方法，合成1 對引物（F1、R1），并設計2 對原核表達引物（CDV3-F2、R2/LYM-F3、R3），5′端引入酶切位點和保護性堿基，預期片段大小分別為1 921 bp 和1 143 bp（見表1）。

表1 引物序列

1.5 H 基因RT-PCR-RFLP 分析 分別以CDV3和LYMRNA為模板，RT-PCR 擴增得到H 全 基因，經回收純化，由本實驗室建立NdeⅠ-RFLP 方法進行鑒定。

1.6 H基因克隆和鑒定 將PCR純化產物與pMD18-T 連接轉化至E.coliDH5a。提質粒，經PCR 和BamHⅠ/HindⅢ酶切鑒定，陽性質粒分別命名為pMD18-T-H1 和pMD18-T-H2，送公司測序。

1.7 Head Domain 基因擴增及原核表達質粒構建以pMD18-T-H1 和pMD18-T-H2 為模板，PCR得到Head Domain 基因。目的片段和pET-30a 質粒均BamHⅠ/HindⅢ酶切后，連接轉化至E.coliDH5a。搖菌提重組表達質粒鑒定正確后，命名為pET-30a-VCHD和pET-30a-LYHD，送公司測序。

1.8 誘導表達及其條件優化 將pET-30a-VCHD、pET-30a-LYHD和pET-30a，按常規方法轉化至BL21（DE3）誘導表達，并對表達條件優化做SDS-PAGE。

1.9 表達產物Western blot 分析 SDS-PAGE 后轉印到PVDF 膜，以兔抗His 標簽單克隆抗體（1∶1 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，進行Western blot。

1.10 表達產物純化 重組菌誘導表達后，經His.tag 蛋白純化試劑盒純化，做SDS-PAGE 分析。

1.11 間接ELISA分析 CDV3/LYM試驗組和生理鹽水對照組分別取12 只6 周齡昆明系小鼠，皮下注射純化蛋白（50 μg/只），加強免疫兩次，每次間隔2 周，自初免后每周對小鼠眼眶采血。將純化蛋白（5 μg/mL）包被，待檢血清1∶80 稀釋，測量OD值。

1.12 細胞中和試驗 采集血清滅活后，倍比稀釋至1∶256，分別與100 TCID50的CDV3 細胞毒混合，于37 ℃孵育1 h 后加入Vero 細胞，逐日觀察結果。

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2 結果

2.1 H 基因擴增及RFLP RT-PCR 產物電泳可見1 921 bp 左右特異性條帶。RFLP 發現，LYM電泳可見約1 282 bp、345 bp 和294 bp 3 條特異性條帶，而CDV3 只有1 條特異性條帶（圖1）。

圖1 H 基因擴增及R FLP

2.2 克隆質粒鑒定 重組克隆質粒pMD18-TH1、pMD18-T-H2 經BamHⅠ/HindⅢ酶切，得到片段大小分別為2 690 bp 和1 921 bp，與預期大小相同（圖2）。測序結果表明，H 基因序列正確。

2.3 Head Domain 基因擴增 以pMD18-T-H1、pMD18-T-H2 為模板，PCR 擴增Head Domain 基因，電泳可見1 143 bp 特異性條帶（圖3）。

2.4 原核表達載體構建與鑒定 質粒pET-30a-VCHD、pET-30a-LYHD經BamHⅠ/HindⅢ酶切，得到片段分別為5 422 bp 和1 143 bp，與預期大小相符（圖4）。表明目的基因均已插入相應克隆位點；測序結果表明，插入片段具有正確閱讀框。

圖2 pMD18-T-H 雙酶切

圖3 H ead Domain基因PCR

圖4 pET-30a-VCH D、pET-30a-LY H D酶切鑒定

2.5 Head Domain-His 誘導表達 結果顯示，重組菌在28 ℃、IPTG 為0.8 mmol/L、誘導6 h 時表達目的蛋白量最大。細菌裂解后在50.8 ku 處出現目的蛋白條帶，而未誘導重組菌和誘導空載體無此條帶（圖5）。

2.6 Western Blot 分析 結果顯示，CDV3-Head Domain 和LYM-Head Domain 重組蛋白相對分子質量約50.8 ku，與預期大小相符（圖6）。表明兩個蛋白均與兔抗His 標簽單克隆抗體結合良好。

2.7 蛋白純化蛋 白純化后獲得較純的重組蛋白（圖7）。

2.8 間接ELISA結果 結果顯示，免疫次數越多，重組蛋白刺激小鼠產生抗體效價越高，且試驗組差異不顯著（P＞0.05）；而對照組抗體效價很低，試驗組與對照組差異極顯著（P＜0.01）（圖8）。說明重組蛋白均能激發機體產生特異性抗體，具有一定免疫原性。

圖5 大腸埃希菌中誘導表達目的蛋白

圖6 H ead Domain Western blot分析

圖7 重組蛋白純化

圖8 間接ELISA結果（OD450值）

2.9 中和試驗結果 結果顯示，對照組免疫后小鼠體內均未檢測到CDV中和抗體。而試驗組在初免后中和抗體效價最高僅達到1∶4（圖9 未顯示），但二免后，兩者抗體滴度均顯著升高，在第21 天達到1∶16；隨后三免，抗體滴度均再次升高，在第35 天達到1∶32，且試驗組差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。表明兩種重組蛋白都有抗病毒活性，且兩者中和效價沒有明顯差異。

圖9 中和試驗結果

3 討論

犬瘟熱病毒H蛋白是Ⅱ型糖蛋白，包括N-末端胞質尾區、跨膜區和C-末端胞外結構域[2]。胞外結構域由α螺旋形成的莖部及其支持的受體結合位點、蛋白抗原區域的球狀頭部組成[3]。Onderstepoort 株球狀頭部域氨基酸序列為228～604 aa[4]。

H 蛋白是犬瘟熱病毒最易變異的蛋白，常用來評估CDV毒株間遺傳演變。CDV野毒株H 基因有一個或兩個NdeⅠ酶切位點，而疫苗株H 基因中沒有，可用來區分疫苗株和野毒株。有研究表明，CDV疫苗株與野毒株的部分氨基酸序列存在較低同源性（89.7%～91.8%），推測CD的免疫失敗可能與兩者遺傳關系較遠有關[5]。但也有研究表明，犬瘟熱野毒株和疫苗株H、N 基因DNA疫苗對受到野毒株攻擊水貂可產生相同保護力，推測兩者抗原差異不會引起免疫失敗[6]。疫苗株和野毒株Head Domain 變化是否對毒株間抗原演變或體液免疫產生影響尚不清楚。為此，本研究用原核表達系統，獲得重組蛋白為Head Domain 研究提供基礎。

本研究對重組蛋白免疫原性進行了鑒定。Western Blot 結果顯示，Head Domain-His 蛋白與兔抗His 標簽單抗特異性結合良好。ELISA結果顯示，隨著免疫次數增加，重組蛋白刺激小鼠產生抗體效價越高，表明重組蛋白具有一定免疫原性，且需多次免疫才能達到較高抗體水平。中和試驗結果表明，CDV3 和LYM的重組蛋白中和抗體效價沒有明顯差異，提示野毒株與疫苗株Head Domain 蛋白抗原差異可能不會影響免疫原性改變，但這一推測仍需本體動物試驗進行深入驗證。

[1]Von Messling V，Zimmer G，Herrler G，et al.The hemagglutinin of canine distemper virus determines tropism and cytopathogenicity[J].JVirol，2001，75（14）：6418-6427.

[2]李天松.不同宿主來源犬瘟熱病毒遺傳分析與生物學特性研究[D].吉林：吉林農業大學，2012.

[3]Katharine N，Bossart，Christopher C，Broder.Paramyxovirus Entry[J].Adv Exp Med Biol，2013，790：95-127.

[4]K Singethan，E Topfstedt，SSchubert，et al.CD9-dependent regulation of Canine distemper virus-induced cell-cell fusion segregates with the extracellular domain of the haemagglutinin[J].Journal of General Virology，2006，87：1635-1642.

[5]王君瑋，姜平，王志亮，等.貂、狐、貉源犬瘟熱病毒分離株H和N 基因的遺傳多樣性分析[J].南京：南京農業大學學報，2007，04：108-113.

[6]Line Nielsen，Trine Hammer Jensen，Birte Kristensen，et al.DNAvaccines encoding proteins from wild-type and attenuated canine distemper virus protect equally well against wild-type virus challenge[J].Arch Virol，2012，157：1887-1896.