重組犬γ 干擾素的分泌表達及抗病毒活性鑒定

姜艷平，吳 煜，張 希，姜新鵬，唐麗杰，喬薪瑗，崔 文，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

犬干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)，是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。它們具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1-2]。犬干擾素其本身并不是一種抗病毒物質(zhì)，它是通過誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白而發(fā)揮其抗病毒作用，或者干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前常用的抗病毒感染和抗腫瘤的生物制品。無論是天然的還是重組的犬干擾素均具有較強的抗病毒能力，臨床上已經(jīng)將重組的干擾素應(yīng)用于防治狂犬病，犬細小病毒病，犬瘟熱等病毒病中[3-4]。

干擾素具有不同的分類方法，目前常用的分類方法是按照主要功能分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω，Ⅱ型干擾素僅包括IFN-γ；其中γ干擾素基因全長為501 個核苷酸，編碼166 個氨基酸，由23 個氨基酸的信號肽和143 個氨基酸的成熟蛋白組成[5-7]，IFN-γ是主要的免疫調(diào)節(jié)干擾素，IFN-γ可以增加細胞表面MHCⅡ類分子的表達，調(diào)節(jié)T 細胞、B細胞和NK 細胞之間的關(guān)系，增強免疫應(yīng)答能力[8]。

本試驗利用生物學(xué)軟件對犬γ干擾素（CaIFNγ）基因進行優(yōu)化，構(gòu)建了可分泌表達CaIFN-γ蛋白的重組乳酸乳球菌表達系統(tǒng)，并通過MTT 法和實時定量PCR 方法對重組乳酸乳球菌表達的CaIFN-γ蛋白的抗病毒活性進行檢測，這對CaIFN-γ在抗病毒活性以及免疫增強方面的作用進行深入研究奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 重組質(zhì)粒pJLA605-CaIFN-γ由本實驗室構(gòu)建；乳酸乳球菌分泌表達型載體質(zhì)粒pAMJ399、乳酸乳球菌PSM565（Lactococcus lactis PSM565），購自BIONEER 公司。

1.2 病毒、細胞及血清 犬腎細胞（MDCK）由本實驗室保存，水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；兔抗CaIFN-γ血清由本實驗室自制保存。

1.3 引物設(shè)計與基因合成 根據(jù)已發(fā)表的CaIFNγ基因序列[9]，并依據(jù)乳酸乳球菌密碼子的偏嗜性和表達載體的酶切位點，在不改變蛋白編碼的基礎(chǔ)上，將原有的CaIFN-γ序列由DNA2.0 公司重新優(yōu)化設(shè)計并合成。利用Primer5.0 生物學(xué)軟件，針對合成的CaIFN-γ基因序列設(shè)計引物P1、P2 用于重組載體的構(gòu)建和鑒定。根據(jù)GenBank 上發(fā)表VSVN 基因的保守序列片段設(shè)計引物P3 和P4，用于SYBR Green real-time RT-PCR 試驗擴增VSV病毒的N 片段；根據(jù)犬β actin 內(nèi)參序列設(shè)計引物P5 和P6 用于犬腎細胞（MDCK）內(nèi)參控制序列的擴增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 重組pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 的構(gòu)建及表達 將優(yōu)化后獲得的CaIFN-γ基因與表達載體pAMJ399 進行連接，電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌PSM565中，篩選含有陽性重組質(zhì)粒pAMJ399-CaIFN-γ的轉(zhuǎn)化菌PSM565 進行培養(yǎng)。將重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/ PSM565 在32 ℃靜置培養(yǎng)，通過自身產(chǎn)酸啟動誘導(dǎo)，24 h 后離心，分別收集上清和沉淀，上清用TCA方法濃縮，沉淀用溶菌酶處理，以不含目的基因的pAMJ399/ PSM565 空載體組的上清和沉淀作為對照。然后以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為參考，通過SDS-PAGE、Western-Blot 試驗方法對誘導(dǎo)表達產(chǎn)物進行分析、鑒定。

1.5 重組乳酸乳球菌培養(yǎng)條件優(yōu)化 為了獲得重組蛋白表達的適宜pH 值和生長條件，將重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSMA565 按1∶100比例接種于含有不同量β-甘油磷酸二鈉的GM17液體培養(yǎng)基中，即GM17 培養(yǎng)基中分別含有1%、1.5%、2%……3.5%β甘油磷酸二鈉。32 ℃厭氧條件下靜置誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，每2 h 取菌液測OD600和pH 值，分析β-甘油磷酸二鈉對重組乳酸乳球菌生長條件的影響。

1.6 犬γ干擾素抗病毒活性檢測

1.6.1 細胞毒性試驗 用0.25%胰酶將生長狀態(tài)良好的單層MDCK 細胞進行消化，用完全培養(yǎng)基稀釋成濃度約2×105/mL 個細胞的懸液，分裝到24 孔板中進行培養(yǎng)，每孔加1 mL，待細胞長滿單層后棄液，用無血清DMEM培養(yǎng)基2 倍倍比稀釋重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFNγ/PSM565 和pAMJ399/PSM565 上清液，分別加入到24 孔板中，每孔100 μL，細胞對照和病毒對照孔加入同等體積的無血清培養(yǎng)液。37 ℃孵育72 h，每天觀察并記錄細胞狀態(tài)。

1.6.2 MTT 法檢測重組干擾素抗病毒活性 96 孔板長滿單層的細胞上接種無血清DMEM培養(yǎng)基2 倍稀釋的重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 和pAMJ399/PSM565 的上清液，每孔100 μL，細胞對照和病毒對照孔加入無血清培養(yǎng)液。37 ℃孵育24 h，棄液，每孔加入100 μL 的VSV（約100 TCID50），細胞對照孔加入100 μL 無血清培養(yǎng)液。待病毒對照孔90%左右病變時，觀察細胞各孔的病變結(jié)果。棄上清，每孔加入5 mg/mL 的MTT 染色液10 μL，37 ℃作用1 h，再加入DMSO100 μL，室溫放置15 min，混勻，酶標(biāo)儀OD470讀值。

1.6.3 Real-Time PCR 測定病毒載量 將正常的細胞組，5 倍重組菌組pAMJ399-CaIF-γ/PSM565 和空載體組pAMJ399/PSM565 上清作用的細胞接種VSV后，孵育24～30 h，待正常細胞組病變完全后，將這3 組細胞的上清液收集。應(yīng)用總RNA提取試劑盒提取細胞液中總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用Real-Time PCR 方法檢測各組細胞中VSV的載量，觀察重組干擾素抗病毒效力。Real-Time PCR 方法中的Ct值由PCR 儀自動給出，ΔCt表示每個檢測樣本中的病毒載量，ΔCt=Ct目的基因—Ct參照基因。ΔCt值與病毒復(fù)制量呈反比，ΔCt值越低VSV感染量越高。

2 試驗結(jié)果

2.1 重組乳酸乳球菌表達系統(tǒng)的構(gòu)建 將篩選獲得的陽性重組質(zhì)粒pAMJ399-CaIFN-γ電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌PSM565 中，提取重組質(zhì)粒進行鑒定；結(jié)果顯示，單酶切目的片段與載體總大小約為7 400 bp，雙酶切和PCR 檢測插入片段長約440 bp（見圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。表明成功構(gòu)建了pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 表達系統(tǒng)。

圖1 重組質(zhì)粒pAMJ399-Ca IFN-γ酶切和PCR 鑒定結(jié)果

圖2 重組乳酸乳球菌蛋白表達SDS-PAG E 結(jié)果

2.2 CaIFN-γ在重組乳酸乳球菌中的表達及鑒定重組菌上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示（見圖2），重組乳酸乳球菌的菌體沉淀中有一條約20 ku 大小的蛋白條帶，與預(yù)期目的蛋白大小相符；重組菌上清和沉淀經(jīng)Western-Blot 分析結(jié)果顯示（見圖3），上清和菌體沉淀中均有約20 ku 的特異條帶出現(xiàn)，與預(yù)期大小相符，說明重組菌能夠誘導(dǎo)表達出目的蛋白，并在菌體和上清中均有表達，但在上清中蛋白含量較低，需進一步優(yōu)化。

圖3 重組蛋白Western-Blot鑒定結(jié)果

2.3 重組犬γ干擾素抗病毒活性的檢測

2.3.1 重組犬γ干擾素細胞毒性試驗 將濃縮5倍、10 倍的含有重組CaIFN-γ蛋白的菌體上清液加入到培養(yǎng)單層的MDCK 細胞中，觀察重組CaIFN-γ對細胞的毒性作用。結(jié)果顯示，正常組細胞呈多角形緊密排列貼壁生長，大小均一；10倍濃縮的空載體組和重組菌組上清作用的細胞大小不一，細胞之間比較疏松，有的沒有典型的多邊形形態(tài)，部分細胞之間有細胞脫落的空隙存在；而5 倍濃縮的上清作用的細胞形態(tài)好于10 倍濃縮，基本與正常細胞的鏡下結(jié)果相似，因此采用5 倍及以下濃縮的上清進行下一步試驗。

2.3.2 干擾素抗病毒活性 原倍和5 倍濃縮的重組菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 上清液作用于鋪滿單層的MDCK 細胞后，接種VSV，觀察細胞病變情況。結(jié)果顯示，與正常細胞相比，重組菌組和空載體組的原倍上清作用后的細胞接種病毒后與病變組細胞差別不大，保護作用不明顯，細胞圓縮，脫落；5 倍濃縮的上清作用的細胞接種病毒后，細胞的形態(tài)與正常細胞組形態(tài)相似，保持四邊形或者多邊形結(jié)構(gòu)緊密排列，表明對細胞具有保護作用。

2.3.3 MTT 法檢測重組干擾素抗病毒活性結(jié)果利用MTT 法檢測活細胞的數(shù)量，從而分析病毒的繁殖情況。由統(tǒng)計分析結(jié)果可知（圖4 所示），5倍濃縮上清的IFN 組相比病毒組差異極顯著（P＜0.01），能夠抑制病毒的生長繁殖。

圖4 MTT 法檢測濃縮后干擾素上清的抗病毒活性

2.3.4 熒光定量PCR 檢測MDCK 細胞攻毒后的病毒載量 應(yīng)用SYBR Green 實時定量PCR 方法測定重組干擾素作用的MDCK細胞接種病毒后的病毒感染量。由結(jié)果可知（圖5），重組菌組pAMJ399-CaIFNγ/PSM565 與空載體組pAMJ399/PSM565 和病毒組的ΔCt值差異極顯著（P＜0.01）。說明重組菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 分泌上清5 倍濃縮作用的MDCK細胞攻毒后的病毒載量明顯低于病毒對照組，γ干擾素起到了明顯的抗病毒作用。

圖5 SY BR G reen real-timeR T-PCR 檢測MDCK 細胞未孵育干擾素和孵育干擾素后VSV感染程度的比較

3 討論

20 世紀80 年代初，人的干擾素基因克隆成功后，各國學(xué)者相繼開展了犬干擾素的研究。其產(chǎn)品可應(yīng)用于臨床的治療或作為免疫佐劑配合疫苗的使用來提高抗體對抗原的免疫應(yīng)答水平[10]。但動物γ干擾素的研究起步比較晚，各項技術(shù)還不成熟，存在著很多問題，首先，重組表達的CaIFN-γ多以包涵體形式存在，利用率較低，其次，CaIFN-γ在不同的表達系統(tǒng)和測定系統(tǒng)上活性不同，因此有待深入研究，逐步優(yōu)化干擾素的使用方法和條件。

目前常用獲得重組蛋白的表達方法主要有真核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、大腸桿菌表達系統(tǒng)和乳酸菌表達系統(tǒng)，真核表達系統(tǒng)獲得的重組蛋白活性好，但產(chǎn)量低，在實際應(yīng)用中比較困難；大腸桿菌表達的重組蛋白經(jīng)常是以包涵體形式存在，不利于重組干擾素的臨床應(yīng)用；乳酸菌表達系統(tǒng)中的乳酸乳球菌，作為表達和傳遞外源基因的載體系統(tǒng)具有益生性、安全性，以及可通過先天性免疫激活腸道黏膜免疫系統(tǒng)，不會刺激機體產(chǎn)生抗體等重要特點，尤其是分泌型載體表達的外源蛋白無需純化，直接可以應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中，近年來受到越來越多的重視。

本研究構(gòu)建重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFNγ/ PSM565，獲得了分泌表達的犬γ干擾素蛋白，將培養(yǎng)pAMJ399-CaIFNγ/ PSM565 的培養(yǎng)上清液進行5 倍濃縮后與MDCK 細胞進行作用24 h后，接種VSV病毒，通過觀察病變、MTT 法檢測活細胞數(shù)及熒光定量PCR 檢測方法，均證實該蛋白能夠抑制VSV的復(fù)制，具有明顯的抗病毒活性。為進一步研究犬γ干擾素在臨床上的抗病毒應(yīng)用和作為細胞因子佐劑的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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