不同氮源對瘤胃真菌產纖維素酶活性的影響

王 光，孫艷朋，王利華

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

氮是構成微生物細胞蛋白和核酸的重要成分。微生物氮的來源可分為無機氮和有機氮，其中無機氮易溶解又有利于吸收；有機氮除含有豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸外，還含有少量糖、脂肪、微量元素及維生素、生長素等營養物質[1]。江微等分別用等量的無機氮源和復合有機氮源代替原培養基中的尿素，結果表明，釘子菇對復合氮源利用最好，菌絲生長旺盛，濃密潔白，與無機氮源差異顯著[2]。而朱永真等的研究表明，尿素為羊肚菌的最優氮源，其次是硝酸鉀和硝酸鈣，然后才是酵母膏等有機氮源[3]。

瘤胃真菌在反芻動物瘤胃中纖維物質分解消化過程中發揮重要的作用[4]。氮源影響真菌生長，而瘤胃真菌又可以產生纖維素酶，所以本試驗研究酵母膏、菌糠、氯化銨、硫酸銨以及尿素作為真菌生長所需的氮源，以羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性和發酵液pH 值的變化為指標，來探討氮源對瘤胃真菌產纖維素酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株 本試驗采用的瘤胃厭氧真菌取自裝有永久性瘤胃瘺管的嶗山奶山羊，用真菌培養基稀釋10 倍，39 ℃培養3 d 后獲瘤胃真菌產酶接種用菌株。

1.2 產酶培養基及試驗設計 產酶培養基的配置參照朱崇淼[5]方法，發酵底物用花生蔓代替。

試驗分6 個處理組，分別用相同質量的供試氮源（酵母膏、菌糠、氯化銨、硫酸銨、尿素）代替產酶培養基中的蛋白胨，以不加氮源為對照。

1.3 測定項目和方法 各處理組分別稱取發酵底物花生蔓0.5 g，裝入封口袋中，然后依次加入45 mL產酶培養基和5 mL 培養3 d 的真菌培養液，每個處理設3 個重復。完畢后擠凈封口袋中空氣并封口，放入39 ℃培養箱中培養，發酵時間分別為0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。在各時間點發酵結束，迅速從各封口袋中抽取適量發酵液上清，備測酶活性，酶活性測定方法參照朱崇淼[5]、王建等方法[6]。

在各個發酵時間點，用pH 計測定發酵液中的pH 值。

1.4 數據處理 試驗數據均采用SAS軟件中的Glm 過程對氮源、培養時間及二者的互作效應進行方差分析，并針對每種氮源的不同培養時間、每個培養時間點不同氮源進行方差分析，用Duncan 氏SSR 進行多重比較。檢驗誤差為5%水平。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶活性測定結果 由表1 可知，不同氮源及培養時間對木聚糖酶活性影響顯著，而且二者的互作顯著（P＜0.001）。木聚糖酶活性達到最高點的時間大致在48 h 或是72 h，5 種氮源組的纖維素酶活性均顯著高于對照組（P＜0.05），其中又以氯化銨組的酶活性為最高，顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。24 h 時有機氮源組的木聚糖酶活性高于無機氮源組，48 h 后無機氮源組木聚糖酶活性迅速升高，并超過有機氮源組達到最高酶活性。培養72 h 氯化銨組、硫酸銨組、菌糠組及酵母膏組的酶活性均達到高峰，但氯化銨組的酶活性顯著高于其他各氮源組（P＜0.05）。

2.2 羧甲基纖維素酶活性測定結果 表2結果表明，不同氮源及培養時間對羧甲基纖維素酶活性影響顯著，而且二者的互作顯著（P＜0.001）。48 h 時，硫酸銨組和酵母膏組酶的活性達到高峰，但與其他氮源組相比差異不顯著（P＞0.05）。72 h 時，氯化銨組、菌糠組和尿素組酶活性達到最高，氯化銨組與尿素組的酶活性無顯著差異（P＞0.05），但氯化銨組酶活性顯著高于其他各時間點及各氮源組（P＜0.05）。

表1 不同氮源對木聚糖酶活性的影響

表2 不同氮源對羧甲基纖維素酶活性的影響

2.3 β-葡萄糖苷酶活性測定結果 不同氮源及培養時間對β-葡萄糖苷酶活性影響顯著，而且二者的互作顯著（P＜0.001）。β-葡萄糖苷酶活性變化趨勢與羧甲基纖維素酶大致相同（見表3），不同之處在于48 h 時，尿素組β-葡萄糖苷酶活性最高。72 h 時，氯化銨組的β-葡萄糖苷酶活性達到最高峰，與酵母膏差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他各氮源組（P＜0.05）。

2.4 不同氮源組pH值變化結果 由圖1 可知，各組pH 值隨著時間增長逐漸下降，5 種氮源組120 h 的pH值下降值與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其中以菌糠組下降最快，相比0 h 時下降了0.86。酵母膏組和尿素組次之，二者之間差異不顯著（P＞0.05）。氯化銨組和硫酸銨組pH 值差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同氮源對纖維素酶活性的影響 對照組的最高纖維素酶活性遠遠低于5 種氮源組，證明了氮源對厭氧真菌生長的重要性。本試驗還發現瘤胃厭氧真菌對無機氮源的利用效果要優于有機氮源。Dijkerman 等報道，Piromyces E2 菌在以銨鹽為氮源時生長最好，以谷氨酸、清蛋白、尿素等為氮源時，該菌的生長效果不好[7]。松乳菇對NH4+-N 和NO3--N 都能加以較好地利用，而其他外生菌和真菌利用NO3--N 的能力較差[8]。史宏志等研究表明，在中等施氮水平下，無機氮比例較大時有利于提高淀粉酶的活性[9]。但也有一些學者認為氨基酸類氮源比銨鹽更有利于真菌生長，而且可以直接合成真菌所需的蛋白質[10]。白愛枝等認為以NaNO3為單一氮源時，72 h 木聚糖酶活力可達211.0 IU/mL，而且一般復合氮源對木聚糖酶產量的提高有利[11]。

表3 不同氮源對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1 不同氮源在不同培養時間對發酵液pH 值的影響

從本試驗測得的酶活性大小看，遠不如Wood等和Lee 等所報道的數據[12-13]。分析原因可能是與菌種差異及不同的發酵工藝有關，本試驗所用發酵底物為粗纖維含量較高的花生蔓，沒有添加玉米、麥麩等碳源。

3.2 不同氮源對發酵液pH 值變化的影響 體外培養時發酵液pH 值的變化受發酵底物，有機酸積聚以及氮源的影響。植物纖維素在消化道內被分解為纖維二糖，再由6-磷酸葡萄糖經過一系列過程生成丙酮酸，丙酮酸再生成丙酸及其他揮發性脂肪酸。厲學武等研究表明，在培養液中按培養底物秸稈添加2%篩選的瘤胃厭氧真菌可顯著提高培養液中菌體蛋白和揮發性脂肪酸含量[14]。能量飼料發酵后會產生揮發性脂肪酸，蛋白飼料發酵后會產生一定量的NH3-N[15]。本試驗表明，菌糠組pH 值下降最為明顯，可能是菌糠相比其他氮源成分比較復雜（粗蛋白7.5%、粗脂肪7.2%、粗纖維45.16%、粗灰分11.3%、無氮浸出物38.19%），發酵時無氮浸出物可能被分解成有機酸，pH 值下降顯著。

4 結論

添加不同氮源對瘤胃厭氧真菌產纖維素酶有一定的影響。從本試驗的結果來看，以氯化銨做氮源可以產生較高活性的纖維素酶；不同氮源對發酵液pH 值也有影響，其中菌糠的影響最為明顯。

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