多肽疫苗對豬圓環病毒2 型的免疫保護效果研究

劉博奇 ，陳善真，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌

（1.廣東海大畜牧獸醫研究院，廣東 廣州511400 ；2.華南農業大學，廣東 廣州 510642）

豬圓環病毒2 型（Porcine Circovirustype 2，PCV-2）是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的主要病原，其感染后破壞動物機體免疫系統，導致其嚴重的免疫抑制，進而誘發多種混合感染和繼發感染，嚴重影響疾病的診斷和治療，已成為世界養豬業的重要病原之一，給養豬業造成巨大的經濟損失。大量的行業養殖現狀和試驗研究表明，疫苗注射是控制圓環病毒2 型感染的有效手段，因此國內外學者針對該病的疫苗研制展開了大量研究，并取得了顯著成果。目前市售的PCV-2 商品化疫苗主要為滅活疫苗及亞單位疫苗，這兩種疫苗的上市對我國防控PCV-2 感染發揮了重大作用，其優點是性能穩定、使用安全、易保存等，但同時也存在疫苗生產成本高、病毒難以培養等困難。由于PCV-2 疫苗在傳統制備方法上尚存在缺陷，因此開發高效低廉的新型疫苗也逐漸被關注。近年來，越來越多的學者將注意力轉移至亞單位和多肽疫苗的研究，多肽抗原作為完整病毒蛋白的一部分，其不具備傳染疾病的危險性，并且可以大量合成生產，因此已成為疫苗研究開發的重要內容之一。

本試驗根據已研發的非蛋白多糖多聚體定位耦聯PCV-2 B、T 細胞免疫活性表位多肽作為抗原，免疫實驗動物，取得了較好的免疫保護效果。同時該技術也可為其他獸用抗病毒生物制品的研發提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 體液病毒核酸少量提取試劑盒為美國愛思進產品；多肽由上海強耀生物科技有限公司合成；市售圓環病毒2 型疫苗為德國勃林格產品；免疫佐劑為廣州鼎國生物制劑產品；豬圓環病毒2 型抗體ELISA檢測試劑盒，購自武漢科前動物生物制品公司；35 日齡仔豬20 頭，購自廣東某豬場育種管理中心；豬圓環病毒2 型由華南農業大學獸醫學院張桂紅教授饋贈。

1.2 耦聯多肽疫苗的制備與鑒定 通過化學合成技術制備幾段含有抗原表位的多肽，序列及出處分別為：PSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSN（Cap 65-87）、QGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPY VNYSS（Cap113-146）、SRYFTPKPVLDRTIDYFQPN NKRNQL（Cap158-183）、DHVGLGTAFENSKY（Cap 194-207）。用本項目組發明的非蛋白多聚體定位耦聯B、T 細胞免疫活性表位多肽技術，制備圓環病毒2 型多肽疫苗。

1.3 試驗動物分組及免疫程序 試驗分為4 個組，分別為耦聯多肽疫苗免疫組、市售疫苗免疫對照組、免疫佐劑對照組和空白對照組，每組5 頭仔豬。耦聯多肽疫苗組和免疫佐劑對照組的免疫劑量為2.0 mL/頭，市售疫苗組的免疫劑量為1.0 mL/頭，空白對照組不免疫。肌肉注射，分3 次免疫，首免（d1），二免（d8）和末次免疫（d23）。

1.4 血清特異性抗體檢測 分別于首次免疫前（d0）、免疫后每周（d8、d15、d22、d29、d36）抽取血液1 次，用ELISA方法進行抗體檢測，觀察抗體產生情況，當抗體滴度趨于平穩時進行攻毒試驗。

1.5 攻毒試驗 于攻毒前3 天（d38）對試驗動物進行免疫刺激。方法：每頭豬兩側腋下及臀部肌肉注射1 mL經弗氏不完全佐劑乳化的KLH（0.5 mg/mL）、腹腔注射巰基乙酸培養基1.0 mL/頭。攻毒（d41）：圓環病毒培養液（106TCDI50）滴鼻1.0 mL/頭并肌肉注射2.0 mL/頭。攻毒后第4 天（d44）同d38 天方法進行免疫刺激處理。在攻毒后第11 天（d51）和第19天（d59），所有豬腹腔注射巰基乙酸培養基1.0 mL/頭。若攻毒后出現瀕死或死亡的豬，及時剖檢觀察其肺、腹股溝及腸系膜淋巴結變化，并分離肺臟及淋巴結，分別冰凍保存和4%中性福爾馬林固定液進行組織固定；存活的豬則在攻毒后第32 天（d72）進行處死，并留取所需組織。

1.6 檢測指標及數據處理

1.6.1 臨床癥狀觀察 每天觀察并記錄其食欲、被毛、皮膚、排便、行動及其他異常等情況，直至動物實驗結束。

1.6.2 體征檢測 分別于免疫當日（d1）、攻毒當日（d41）和宰殺當日（d72）稱量所有豬的體重，計算各組在不同試驗階段的增重情況。于攻毒當日開始記錄體溫，每天上午10 點鐘測定，直至體溫未見明顯升高，恢復平穩為止。

1.6.3 Real-time RCR 檢測 分別于攻毒前3 d（d38）、攻毒后每周（d48、d55、d62、d69、）抽血一次，用Real-time RCR 方法檢測攻毒后不同階段血液內的病毒含量。于動物宰殺時（d72）取新鮮肺及淋巴結組織，檢測組織中病毒含量。

1.6.4 組織病理學檢查 對福爾馬林固定的肺及淋巴結進行常規石蠟切片及H.E.染色，并進行讀片觀察。

2 結果與分析

2.1 特異性抗體檢測結果 免疫前（d0）抽血檢測所有樣本豬圓環病毒2 型抗體均為陰性，首次免疫后1 周（d8），耦聯多肽疫苗免疫組和市售疫苗免疫對照組大部分樣本檢測到抗體，二免后，抗體水平呈上升趨勢，經過加強免疫后，第4 周（d29）抗體滴度水平達到最高，第5 周（d36）檢測抗體水平趨于平穩（見圖1）。

圖1 不同免疫階段特異性抗體檢測結果

2.2 臨床癥狀 4個試驗動物組在免疫前及攻毒前，動物的食欲、被毛、皮膚、行動及精神狀態等觀察均正常。攻毒后，耦聯多肽疫苗和市售疫苗兩個免疫組臨床觀察未見明顯異常；免疫佐劑對照組和空白對照組分別在攻毒后第9天和第7天出現精神委靡、被毛雜亂等，過2～3 d 開始嘔吐、水便、投食前臥地不起，空白對照組在攻毒后第11 天、第12 天早上各有1 例動物便血，中午發現死亡。

2.3 攻毒前后體征變化 免疫后至攻毒前，各個組的整體增重較平均，組間未見明顯差異。攻毒后至宰殺前，耦聯多肽疫苗組及市售疫苗組兩組的增重略有下降，但與攻毒前差別不大；而對照兩組的增重則明顯下降（見圖2）。

圖2 不同試驗階段各組平均增重

攻毒第2 天，各組體溫均有升高，但免疫佐劑對照組及空白對照組體溫升高明顯。至攻毒后第10 天，多肽疫苗及市售疫苗組體溫趨于平穩，恢復至攻毒前水平；對照兩組的體溫較攻毒前仍略偏高（見圖3）。

圖3 攻毒后各組動物的平均體溫變化趨勢

2.4 Real-time PCR 檢測結果 4 個組在攻毒前及攻毒后1 周、2 周的血液內均未檢測出病毒，攻毒后3 周和4 周在空白對照組和免疫佐劑對照組分別檢測出較高含量的病毒，而疫苗免疫兩組未檢測出。攻毒試驗結束后，佐劑及空白對照組均在肺及淋巴結組織中檢測到較高含量的病毒，而疫苗免疫兩組亦未在組織中檢測到病毒。

2.5 組織病理學檢查結果 耦聯多肽疫苗及市售疫苗免疫兩組的易感組織：肺臟和淋巴結大體觀察未見明顯異常；組織學觀察未見明顯病變（見中插彩版圖4A-D）。免疫佐劑及空白對照兩組：大體觀察見肺臟腫脹、呈灰褐色彌漫性病灶、質硬，淋巴結腫大、切面質硬；組織學觀察見肺組織細胞及巨噬細胞增生、彌散性肺泡壁增厚、局灶性肉芽腫性間質肺炎（見中插彩版圖7E、G）；淋巴結皮質區淋巴小結排列疏松、淋巴細胞減少，副皮質區可見上皮樣細胞，胞漿內見嗜酸性包涵體（見中插彩版圖7F、H）。具體病理組織圖片見圖4。

3 討論

本研究所用的多肽疫苗是根據PCV-2 病原體抗原基因中已知和預測的某段抗原表位的氨基酸多肽序列，耦聯到大分子多糖載體上所得到的多肽。大分子量載體作用是增強其免疫效果，傳統方法是應用戊二醛等連接分子法將有效抗原肽接到載體蛋白鑰孔血藍蛋白（KLH）、人血清白蛋白（HSA）、卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）及破傷風類毒素（TT）上，但是此類抗原肽-載體復合疫苗中的載體蛋白通常為異體蛋白，因此在免疫接種時容易引起炎癥或過敏反應，還會影響抗原肽的特異性，因此選擇一種無過敏反應的載體尤為關鍵。本研究所采用的載體是優選的具有可耦聯基團的非蛋白多聚體，與免疫活性多肽耦聯，制備成耦聯多肽疫苗，試驗驗證其不但具有顯著的免疫活性及穩定性，還避免了傳統多肽-載體蛋白疫苗所引起的炎癥或過敏反應等毒副作用，極大的提高了多肽疫苗的安全性和特異性，且其具有制備工藝簡單、成本低、質量可靠等優點，利于規模化生產。

體液免疫效果是疫苗免疫評價重要標準之一，本試驗針對PCV-2 特異性抗體進行動態檢測，其結果表明，本研究制備的耦聯多肽疫苗具有與市售疫苗相似的免疫效果，可以有效提高機體體液免疫能力。臨床癥狀觀察及體征檢測同樣可以對疫苗免疫效果做出客觀評價，臨床觀察經多肽疫苗免疫的豬在攻毒后未見發病及死亡，增重及體溫檢測也說明攻毒后的多肽疫苗組動物體征與對照組變化差異明顯，與攻毒前體征水平相當，表明耦聯多肽疫苗臨床免疫具有良好的保護效果。

豬感染PCV-2 后，不但可以通過胎盤進行垂直傳播，還可經鼻液和糞便進行水平傳播，該病毒對環境理化因子抵抗力極強，在酸性及高溫環境下同樣可以存活一定時間。因此，有效減少排毒量，減短帶毒血癥時間，是評價PCV-2 疫苗的重要標準之一。本試驗通過檢測攻毒后不同階段的各組動物血液內病毒含量，表明經多肽疫苗免疫的豬能夠有效抑制病毒血癥的發生。同時，病毒可存在于機體多個器官，并導致相應器官的功能異常，其中淋巴結和肺臟是PCV-2 病毒復制的重要的器官，感染后不但可以造成呼吸功能障礙，更重要的是可以引起機體免疫抑制，為其他病原的感染提供途徑，因此，高效PCV-2 疫苗應該具有有效減少淋巴結、肺臟等病毒靶器官內病毒滴度的能力。本試驗在耦聯多肽疫苗免疫組的淋巴結及肺臟組織樣本中未檢測出病毒，表明該多肽疫苗具有良好的阻斷病毒感染靶器官的能力。病理學觀察結果同樣表明，實驗動物免疫該耦聯多肽疫苗后，與對照組相比較，淋巴結和肺臟未出現病理變化，再次說明，本研究所用耦聯多肽疫苗可以有效抑制PCV-2 病毒在靶器官內的復制，并減少病毒所致的病理變化，避免機體出現免疫抑制、呼吸功能障礙等臨床癥狀。

綜上所述，本研究結果表明，PCV-2 耦聯多肽疫苗具有較好的免疫效果及保護率。作為一種候選新型疫苗，其獨特的優點能為企業和市場帶來新的經濟增長點與競爭力，市場空間巨大。同時該疫苗的研制方法也可為其他相關疾病疫苗的研制提供重要的理論基礎和技術支持，對我國動物疫苗的研發具有重要的現實意義。

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