嗜酸乳桿菌S層蛋白抗NDV感染雞腸上皮細胞作用初探

張 萍，賈國東，魏 萍

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

益生菌具有抗致病微生物的作用已經得到普遍認識，其菌群中特別是嗜酸乳桿菌具有較明顯的抗致病微生物性質[1]。S層蛋白是嗜酸乳桿菌表層重要的蛋白質，有保護菌體維持形狀、作為物質交換的分子過濾篩、參與細胞識別與粘附等功能，而且是菌體適應周圍環境的重要結構，S層蛋白具有粘附小腸上皮細胞的特性，是腸道內益生菌定植不可或缺的結構[2-4]。為了證實S層蛋白在菌體發揮抗病毒功能中的作用程度,評價嗜酸乳桿菌抑制病毒感染宿主細胞的能力，本試驗以嗜酸乳桿菌為益生菌的代表，評價與研究S層蛋白在抗病毒作用中的參與程度以及作用原理，以期為益生菌的后續研究提供最基礎的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種 嗜酸乳桿菌（La-A），毒株:新城疫IV系疫苗毒（LaSota 株），東北農業大學傳染病教研室保存。

1.2 NDV的細胞毒力測定 采用Reed-Muench 法測定兩種病毒各自的半數組織感染量（TCID50）。

1.3 嗜酸乳桿菌試驗前處理

1.3.1 菌體活化 試驗時經MRS平板活化后，37 ℃培養21～24 h，連續轉接3 代。

1.3.2 益生菌生長曲線的測定 將完成活化菌株按0.1 mL/管的接種量分別接于11 支盛有10 mL MRS液體培養基的試管中，測其600 nm 處的光密度值（OD600值）。

1.3.3 嗜酸乳桿菌藥敏試驗 結果參照文獻：1 000 U/mL 的慶大霉素能顯著抑制此菌的生長。

1.3.4 菌體的細胞毒性測定 將已處理好的不同濃度活菌體加入已長成單層的96 孔細胞培養板中，置溫箱中培養90 min，之后棄去孔中液體，再加入含有1 000 U/mL 慶大霉素細胞維持液繼續培養。按時觀察細胞病變（CPE）情況，測定細胞活性得到其最大無毒劑量。

1.4 S層蛋白對IEC毒力的測定 將蛋白按照以下濃度梯度用細胞維持液稀釋0.2 mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL，0.6 mg/mL，0.7 mg/mL，0.8 mg/mL，0.9 mg/mL，1.0 mg/mL 加入待檢細胞。按時觀察細胞病變（CPE）情況，測定細胞活性得到其最大無毒劑量。

1.5 嗜酸乳桿菌不同成分抗NDV感染IEC作用研究 試驗分3 種處理如下：（1）預防性試驗。預先將每個試驗組成分以0.1 mL 量分別孵育細胞90 min，后以100 TCID50/0.1 mL 的病毒量接入細胞孔0.1 mL，再次孵育90 min，洗滌后加入細胞維持液繼續培養；（2）治療性試驗。以100 TCID50/0.1 mL 的病毒量0.1 mL 接入細胞孔與細胞孵育90 min，后加入0.1 mL 每個試驗組繼續孵育90 min，之后洗滌加入細胞維持液繼續培養；（3）混合感作試驗。將各個試驗組分別與100 TCID50/0.1 mL的病毒等體積孵育90 min，之后共同接入細胞，繼續孵育90 min，之后洗滌加入正常維持液培養。用MTT 方法檢測各組細胞活力。

1.6 檢測S層蛋白與牛血清白蛋白對NDV的粘附能力 用常規ELISA方法進行檢測S層蛋白與牛血清白蛋白對NDV的粘附能力，測定OD490nm 值。

1.7 S層蛋白與牛血清白蛋白抗病毒感染IEC將各個試驗組分別與100 TCID50/0.1 mL 的病毒等體積孵育90 min，之后共同接入細胞，繼續孵育90 min，之后洗滌加入正常維持液培養孵育。S層蛋白稀釋度與白蛋白稀釋度0.1～1.0 mg/mL。

2 結果

2.1 NDV的細胞毒力測定結果 用Reed-Muench法計算得NDV毒力為10-3.85TCID50/0.1 mL。

2.2 嗜酸乳桿菌生長曲線

2.2.1 嗜酸乳桿菌生長曲線 試驗選取其進入穩定期21 h 為收獲菌體時間點。

2.2.2 嗜酸乳桿菌的最大無毒劑量結果 通過觀察細胞CPE 變化程度，得出嗜酸乳桿菌最大無毒劑量為1011CFU/mL。

2.3 嗜酸乳桿菌不同成分抗NDV感染IEC作用試驗結果與分析 表1 數據顯示，菌體對抑制病毒的抑制率隨濃度升高而增強，108CFU/mL 濃度時最高抑制性。

表1 菌體不同接入順序對NDV抑制率的組間比較（平均值±標準差）

表2 數據可見，脫S層蛋白菌體對病毒依然具有抑制性，治療試驗對病毒的抑制率極顯著的低于其他兩組，混合感作試驗比預防試驗組的病毒抑制率顯著性增強。

表2 脫S層蛋白菌體不同接入順序對NDV抑制率的組間比較（平均值±標準差）

表3 數據中S層蛋白最強作用濃度0.8 mg/mL，其中在每組濃度數據中，0.7～1.0 mg/mL 組的混合感作試驗抑制病毒效果顯著性高于預防組、極顯著高于治療組；0.3～0.6 mg/mL 組中混合感作組抑制病毒率顯著高于預防組，極顯著高于治療組。

表4 數據顯示，2、4、6 倍稀釋液的病毒抑制率中，混合感作試驗顯著強于預防組，極顯著強于治療組；8、10 倍稀釋液的病毒抑制率中，預防組與混合感作組作用相當，都顯著強于治療組；12倍的抑制率三者均較低，作用強度無顯著差異。

2.4 S層蛋白和牛血清白蛋白對NDV粘附能力試驗結果 表5 數據顯示，S層蛋白和牛血清白蛋的組間比較（平均值±標準差）白對NDV粘附量均隨蛋白濃度增大而增加，S層蛋白對病毒的粘附性稍強于白蛋白對病毒的粘附。

表3 S層蛋白不同接入順序對NDV抑制率

表4 菌體培養上清液不同接入順序對NDV抑制率的組間比較 （平均值±標準差）

2.5 S層蛋白與牛血清白蛋白抗病毒感染IEC試驗結果 經混合感作方式試驗得出S層蛋白在濃度0.6 mg/mL 時的抑制NDV能力為0.826±0.022Aa，而同濃度下白蛋白為0.196±0.018Bb。由此可見，S層蛋白在此濃度下抑制病毒能力顯著高于白蛋白。

表5 S層蛋白和白蛋白粘附性

3 討論

活菌體主要是通過占位作用、粘附病毒、封閉細胞表面病毒受體和改善細胞自身狀態來發揮其抗病毒作用的。從試驗結果來看，S層蛋白對NDV抑制率最大達到88.9%，脫S層蛋白菌體對NDV抑制率最大達到48.9%，由此可見，S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中發揮了重要的作用。通過粘附試驗可以看出，S層蛋白具有對腸上皮細胞的粘附能力，既是嗜酸乳桿菌定植的關鍵蛋白，又具有對一些病毒的粘附能力從而降低病毒的感染。在預防試驗和治療試驗的結果可以看出，菌體成分預防試驗和混合感作試驗的兩種病毒抑制率都高于治療試驗，說明當病毒感染細胞，益生菌成分無法起到明顯的抑制病毒增殖性質。菌體在代謝過程中產生大量的次級代謝產物，如細菌素、維生素、多糖、小分子肽類及酸性代謝產物等等。在這些成分的刺激下可以抑制病毒活力，影響病毒對宿主細胞的粘附，還可以提高宿主細胞的自身免疫功能水平，綜合起到抑制病毒感染宿主細胞的作用。通過以上試驗可以看出，菌體對病毒的抑制作用是多方面共同發揮的結果，本試驗僅是建立了雞原代培養的腸上皮細胞作為平臺，進行了菌體抗病毒的初步探索，對S層蛋白抗病毒的具體機制還需要深入研究。

[1]潘渠，胡福泉.S層蛋白質的功能和應用[J].生命的化學，2006，26（4）：318-321.

[2]王占鋒.雞胚腸組織細胞培養及益生菌抗NDV作用研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2010.

[3]Garrote G L，Delfederico L，Bibiloni R，et al.Lactobacilli isolated from kefir grains：evidence of the presence of S-layer proteins[J].Journal of dairy research，2004，71（2）：222-230.

[4]Smit E，Oling F，Demel R，et al.The S-layer Protein of＜i＞Lactobacillus acidophilus＜/i＞ATCC4356：Identification and Characterisation of Domains Responsible for S-protein Assembly and Cell Wall Binding[J].Journal of molecular biology，2001，305（2）：245-257.