匹伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

尤 楊， 馮 倩， 夏 岳， 戚國慶， 楊志瑜

(1.河北醫科大學第一醫院心內三科， 河北 石家莊 050031 2.河北省張家口市第一醫院心內三科， 河北 張家口 075000)

匹伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

尤 楊1， 馮 倩2， 夏 岳1， 戚國慶1， 楊志瑜1

(1.河北醫科大學第一醫院心內三科， 河北 石家莊 050031 2.河北省張家口市第一醫院心內三科， 河北 張家口 075000)

目的:探討匹伐他汀對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用，為他汀類藥物在缺血再灌注心肌的臨床應用上提供理論依據。方法:成年雄性SD大鼠42只隨機分為假手術組(Sham組)、對照組(IR組)及實驗組(Statin組)，每組14只。Sham組與IR組術前給予生理鹽水2mL/d灌胃4周，Statin組給予匹伐他汀0.42mg·kg－1·d－1，溶解成2mL灌胃4周。制作大鼠心肌缺血－再灌注模型時假手術組冠狀動脈下只穿線，不結扎，無缺血－再灌注發生。IR組、Statin組均結扎冠狀動脈前降支(LAD)30min，再松解120min。術后檢測血清中肌酸激酶同工酶(CK－MB)水平，用氯化三苯基四氮唑(TTC)及伊文氏藍(Evans blue)雙染色法測定各實驗組心肌梗死面積及缺血區面積。結果:與Sham組相比，IR組、Statin組的血清CK－MB水平顯著升高(P＜0.01);Statin組CK－MB升高水平低于IR組(P＜0.05)。I/R組、Statin組缺血區面積差別無統計學意義(P＞0.05)。與I/R組相比，Statin組梗死面積顯著減小(P＜0.05)。結論:匹伐他汀可以減少缺血再灌注后心肌梗死面積，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

心肌缺血再灌注損傷; 匹伐他汀; CK－MB; 心肌梗死面積

目前再灌注治療已廣泛應用于各種急慢性心肌缺血人群，尤其是對于急性心肌梗死患者，盡早開通梗死相關動脈，迅速恢復梗死相關動脈的前向血流，可以挽救瀕臨死亡的心肌、限制梗塞面積、保護心肌泵功能、改善預后。然而近年來研究發現再灌注治療可使缺血心肌在一定時間內恢復血液再灌注，但原心功能不僅沒有恢復，反而出現了功能代謝障礙及結構破壞進一步加重的現象，即心肌缺血再灌注損傷(MIRI)［1］。他汀類藥物是目前臨床上應用最廣泛的調脂藥物，且在防治心肌缺血再灌注損傷的研究中，他汀類藥物顯示出不同時段、不同機制的心臟保護作用，本實驗選用第三代他汀藥物“匹伐他汀”，制作匹伐他汀預處理的大鼠心肌缺血－再灌注模型，觀察匹伐他汀預處理對大鼠心肌梗死面積的影響，并進一步探討其對心肌缺血再灌注損傷的影響及機制，為他汀類藥物在干預缺血再灌注心肌的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料:實驗動物:實驗用成年雄性清潔級SD大鼠，由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號:醫動字第04038，動物等級:無特定病原體動物。主要試劑:肌酸激酶同工酶(CK－MB)檢測試劑(河北醫科大學第一醫院檢驗科);伊文思藍(Evans blue美國Sigma公司);氯化三苯基四氮唑(TTC美國 Sigma公司); 10%水合氯醛(河北醫科大學臨床醫學院中心實驗室);10%福爾馬林溶液(河北醫科大學臨床醫學院中心實驗室);匹伐他汀片劑:(2mg/片，日本興和株式會社)。主要儀器:ECG－9620P三道自動分析心電圖機(上海光電醫用電子儀器有限公司);HX－3實驗用人工呼吸機(正達實驗儀器開發公司);手術器械、7/0 Prolene線(河北醫科大學第一醫院手術室);電子天平(德國Sartorius AG公司);SBHW－IV電熱恒溫水浴箱(北京市醫療設備廠);LDZ5－2型低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠);－20℃冰箱(青島伊萊克斯有限公司);UNICEL DXC800全自動生化分析儀(德國BECKMAN COULTER公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作:參考文獻［2，3］的方法:經10%水合氯醛以3mL/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸機。實驗大鼠四肢皮下均插入針式電極，將電極尾端連接于心電圖相應的肢體導聯線上，選取Ⅱ導聯作為記錄導聯，記錄正常心電圖(紙速 100mm/s，電壓20mm/mV)對照。開胸，暴露左心耳與肺動脈圓錐之間的心大靜脈，并以此血管為標志，結扎冠狀動脈前降支(LAD)。先在結扎線下放一根lmm的乳膠管，結扎過程中嚴密監測心肌顏色改變，如心肌顏色變深，則結扎松緊度相對適宜。將LAD結扎30min，然后松線120min。模型制作成功標準:結扎LAD后左室前壁局部心肌立刻由鮮紅立即變深、紫紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高≥0.2mV，T波電壓增高，或QRS波幅升高及時限增寬;松開結扎線恢復冠脈血流，缺血部位心肌顏色恢復，T波迅速回落、ST段驟降50%以上提示冠狀動脈成功再通。

1.2.2 動物分組:SD大鼠共42只，隨機分為3組，術前3個組均于每日上午8:30～9:30，25℃室溫下以生理鹽水等量等溫灌胃，每日1次。假手術組(Sham組，n=14):生理鹽水2mL/d灌胃4周，術中LAD下只穿線，不結扎，無再灌注。缺血再灌注組(I/R組，n= 14):生理鹽水2mL/d灌胃4周，術中結扎 LAD 30 min，再松解120 min。匹伐他汀組(Statin組，n=14):術前匹伐他汀0.42mg·kg－1·d－1用生理鹽水溶解成2mL，每日1次，灌胃4周。

1.3 觀測指標:①心電圖;②CK－MB:各組隨機抽取8只大鼠于實驗結束時間點開腹，取靜脈血1mL加入促凝管，室溫靜置離心后取上層血清，－20℃冰箱中保存，用UNICEL DXC800全自動生化分析儀測定CKMB含量;③心肌梗死面積:各組余6只大鼠，于實驗結束時間點原位結扎LAD，將1mL 5%Evans blue溶液注入左室內以標記缺血區(無藍色)和非缺血區(藍色)，待大鼠口唇青紫時迅速取左心室，取心尖端3mm厚心肌(垂直心室長軸方向)，其余心肌組織置于－20℃冰箱30min，自心尖向心底部取2mm厚切片5片(垂直心室長軸方向)，置于1%TTC溶液中，在37℃恒溫水浴箱中避光孵浴10～15min以標記缺血區及梗死區，再以10%福爾馬林溶液固定24h以增強染色顏色對比。選取朝向心尖部的切面為面積分析切面:藍色為正常心肌，粉色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌。用計算機分析軟件測定梗死區面積(AN):梗死面積為心臟總梗死區面積占總危險區面積(AAR，即缺血區與梗死區面積之和)的百分比(AN/AAR)，危險區面積為危險區面積占左室面積(LV)的百分比(AAR/LV)。

1.4 統計學方法:應用SPSS13.0軟件進行統計分析。數據以正態性齊性檢驗，正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間兩兩比較采用q檢驗;非正態分布的計數資料用中位數表示，比較采用秩和檢驗。P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 心電圖變化:結扎LAD前大鼠Ⅱ導聯心電圖顯示心律齊，無ST－T及QRS波的改變;成功結扎LAD后，心電圖出現ST段弓背向上抬高≥0.2mV，伴或不伴T波高尖，新發病理性Q波或原q波加深，QRS波群增寬;再灌注后出現T波迅速回落、ST段下降≥50%，再灌注時記錄有房室傳導阻滯、室性心動過速、心室顫動等再灌注心律失常發生。

2.2 血清CK－MB水平比較:與假手術組比較，IR組、Statin組的血清CK－MB水平升高顯著(P＜0.01)，Statin組CK－MB升高水平低于IR組(P＜0.05)。見表1。

2.3 心肌梗死面積的比較:IR組、Statin組AAR/LV差別無統計學意義(P＞0.05)。與IR組相比，Statin組梗死面積顯著減少(P＜0.01)，具有統計學意義。(見表2)。

表1 血清CK－MB水平比較(±s，n=8)

表1 血清CK－MB水平比較(±s，n=8)

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與IR組比較，#P＜0.05

假手術組(IU/L)缺血再灌注組(IU/L)匹伐他汀組(IU/L) CK－MB 19.88±3.60 84.25±9.25* 76.88±5.82*#

表2 心肌梗死面積的比較(±s)

表2 心肌梗死面積的比較(±s)

注:與I/R組比較，*P＞0.05，#P＜0.01

部位 組別缺血再灌注組 匹伐他汀組P AAR/LV(%) 37.31±5.05 36.49±3.65* 0.754*AN/AAR(%) 65.44±7.61 48.57±9.14# 0.006#

3 討 論

目前臨床上心肌缺血再灌注治療可使缺血相關冠狀動脈盡早、最大程度地持久開通，恢復有效的冠狀動脈前向血流，縮小心肌梗死面積，抑制心室重構，保護心肌功能，提高此類患者的存活率，改善預后。但目前臨床工作中常可觀察到再灌注治療后反而出現了心律失常、心肌頓抑、心肌細胞壞死以及與內皮細胞及微血管功能障礙相關的“無復流”現象。CK－MB是一種存在于心肌細胞內的蛋白酶，當心肌細胞受損時，這種蛋白酶便可通過受損的細胞釋放到血液中，故外周血血清中CK－MB水平變化可以作為反映心肌細胞壞死程度的較敏感指標。他汀類藥物是目前臨床上常用的調脂藥物，目前多項臨床試驗均已證實長期應用他汀類藥物可減少冠脈事件的發生，尤其是急性心肌梗死早期缺血相關事件的發生。本實驗結果顯示:經過匹伐他汀預處理后的大鼠與單純缺血再灌注組大鼠比較，血清CK－MB升高程度顯著降低，而心肌梗死面積也顯著減小，說明匹伐他汀預處理可以明顯減輕缺血再灌注心肌損傷。近年來，國內外多項他汀類藥物相關研究發現:大鼠心肌缺血前給予相應的預處理方案，經歷了再灌注后其心肌梗死面積顯著減少，且減少幅度可能與他汀類藥物的使用存在劑量依賴性。

因為目前他汀類藥物對心肌缺血再灌注損傷的保護作用機制尚不明確，推測可能與他汀類藥物的多途徑心臟保護作用有關。大量臨床試驗研究證明，他汀類藥物的降膽固醇作用，可顯著降低冠心病一級和二級預防中各類冠狀動脈事件的發生率，也可在二級預防中降低全因死亡率［4］。另外，他汀類藥物還存在強大的獨立于調脂作用之外的其它保護作用，即他汀類藥物的多效性。他汀的非降脂作用包括:改善血管內皮功能［5］、抗炎［6］、抗氧化應激［7］、抗血小板聚集和抑制血栓形成［8］、抑制心臟電生理重構、調節心臟植物神經功能［9］等。最近研究還發現他汀類藥物可以明顯減輕MIRI［10～12］。他汀類抗心肌缺血再灌注損傷是通過NO實現的［13，14］。Tavackoli等［15］選用辛伐他汀給大鼠進行預處理3d后制作I/R模型，結果顯示辛伐他汀預處理組心肌梗死范圍較單純I/R組顯著減小。短期阿托伐他汀治療能明顯減少I/R心肌梗死面積，降低血清CK、LDH水平，減輕大鼠心肌I/R損傷，使經皮腔內冠狀動脈成形術(PTCA)后患者血中可溶性細胞黏附因子－1水平降低，對防止PTCA后細胞黏附、血管再閉塞起一定作用。他汀類藥物還可以破壞氧化應激，降低還原型輔酶活性、抑制核因子(NF)－κB、活性氧、髓過氧化物酶、白細胞的粘附和活性及炎癥介質的表達，上調抗氧化酶活性，從而降低炎癥反應;另外，此類藥物可抑制人體內皮細胞RhoA蛋白的活性、抑制RhoA蛋白向細胞膜的轉錄，增加NO的產生和釋放，抑制動脈粥樣硬化和內膜增生進程，發揮其對心肌及血管的保護作用。

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The Positive Role of Pitavastatin in Prevention of Ischemia－reperfusion Myocardial Injury

YOU Yang， et al
(The First Hospital of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang050031，China)

Objective:To explore the positive role of pitavastain in a rat model of myocardial ischemiareperfusion，provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia－reperfusion.Method:A total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups:Sham group，control group(IR group)and experimental group(Statin group).In Sham group and control group，2mL saline were irrigated into stomach daily for 4 weeks，0.42mg/kg pitavastain dissolved in 2mL saline were given in experimental group.In surgery，we weared line under the coronary artery without ligation in Sham group，and ligated the line for 30 minutes and then released it for 120 minutes in IR group and Statin group.The levels of CK－MB were discerned after operation.Triphenyl tetrazolium chloride and Evans blue double staining method was used to determinat the myocardial infarct size and ischemic area in each experimental group.Result:The levels of CK－MB in control group and experimental group elevated significantly compared with Sham group(P＜0.01).The level of CK－MB in IR group was significantly higher than Statin group(P＜0.05).There was no significant difference in I/R and Statin group compared with ischemic area(P＞0.05).But when it comes to infarct size，it was more smaller in Statin group(P＜0.05).Conclusion:Pitavastatin couldreduce the cardiac infarct area and alleviate myocardial ischemia－reperfusion injury.

Myocardial ischemia－reperfusion injury; Pitavastatin; CK－MB; Cardiac infarct area

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.002

1006－6233(2015)05－0709－04

河北省科學技術研究與發展計劃，(編號:112761155)