草魚出血病及其疫苗研究進展

王強+汪開毓

摘 要 草魚（Grass carp）是我國淡水養殖的四大家魚之一，養殖范圍廣，經濟價值高。但在草魚養殖飼養過程中，易發生各種疾病，給草魚養殖業帶來巨大損失。其中，草魚出血病是影響草魚養殖的重要疾病之一，其病原為草魚呼腸孤病毒。對于該病國內目前對其做了大量研究，化學藥物難以達到治療目的而免疫技術在該疾病的防治上取得了一定成就。基于此，首先總結了近年來關于草魚出血病的研究，著重闡述草魚出血病的病原生物學特征以及流行病學相關情況；而后就國內目前草魚出血病疫苗研究情況做一介紹并提出該病防治的新展望。

關鍵詞 草魚出血病；草魚呼腸孤病毒；流行病學；疫苗

中圖分類號：S941.41+1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2014）12--4

草魚（Grass carp）屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，草魚屬。一般喜居于水的中下層和近岸多水草區域，性活潑，游泳迅速，為典型的草食性魚類。因其生長迅速，飼料來源廣，是中國淡水養殖的四大家魚之一。但是在草魚飼養過程中易發生各種疾病，其中草魚出血病是一種最為常見的草魚疾病，這種疾病嚴重應先我國草魚養殖業的發展[1]。早在20世紀70年代我國就開始研究草魚出血病，80年代發現草魚出血病病源——病毒顆粒[2-3]，90年代初國際病毒分類委員會將草魚出血病病源命名為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）[4]。草魚出血病病毒主要侵染草魚的內臟組織，而化學藥物難以達到治療目的，目前仍然沒有找到一種效果良好的特效藥。但是，從免疫系統角度出發研究此病，能夠在水產養殖疾病方面取得一些進展[5]。隨著生物制劑技術的發展，免疫接種疫苗能夠有效地減少疾病的發生。故探討草魚出血病流行病學特征以及草魚出血病疫苗的研制情況對于草魚出血病的預防，減少草魚養殖業中的經濟損失非常重要。

1 出血病病毒生物特性

草魚出血病病毒（Grass Carp Haemorrhage Virus，GCHV）是水生呼腸孤病毒，隸屬呼腸孤病毒科，水生動物呼腸孤病毒屬，因此又稱為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）。病毒形態結構與正呼腸孤病毒相似，隨著科技的發展和醫療技術的進步以及計算機網絡、三維技術的提高，病毒研究工作也得到了有效的進展。方勤等[7]對該病毒的衣殼蛋白特性和三維重構研究，研究結果顯示：GCRV顆粒排列在RNA核心與內/中/外殼層，呈現多層排列的特點。病毒的外衣殼是由200個按T=13對稱排列的三聚體構構成。該病毒排列的特點是在5次軸上出現三聚體缺失凹陷區，三聚體亞單位暴露出中間層，而內殼層由T=1排列的120個病毒單體組成。

此病毒基因組為雙股RNA，由11個片段組成，核酸的總分子質量為1.55×107u[8]。該病毒完整的病毒粒子在氯化銫（CsCl）一定的密度梯度離心浮力密度、蔗糖梯度離心以及沉降系數等狀態下呈現出一定的形式，對熱（56 ℃，1 h）穩定，而在65 ℃，1 h完全失活[9]。病毒對類脂溶解（如氯仿）不敏感，對酸（pH=3）、堿（pH=10）處理不敏感。經酸處理后，毒力增強，滴度提高，另外，此病毒毒性的提高還與草魚體內精氨酸和胰蛋白酶量增加有關[10]。

GCRV不僅能在草魚自身體內繁殖，而且具有遺傳性，它能夠在草魚體內產生合胞體狀細胞病變效應（CPE）[11]。此病毒可在GCO、GCK、CIK、ZC-7901、PSF以及GCF等草魚細胞株內增殖。胞漿內的病毒呈晶格狀排列，在溫度為28 ℃時復制速度最快，一般情況下，草魚在此溫度環境下感染病毒12 h以后病毒就開始復制，24～27 h以后病毒開始大量繁殖，侵害操于體內的正常細胞，使之病化，細胞標體會出現2 mm長的空斑[12]，這種表象是草魚細胞受感染的重要標志。

2 草魚出血病病毒致病機理分析

病理組織學觀察，可見全身毛細血管內皮細胞受損，血管壁通透性增高引起毛細血管或小血管出血以及形成血栓。由于血液循環的障礙，導致全身各臟器組織不同程度的變性壞死。血液學指標檢測顯示，紅細胞、白細胞和血紅蛋白顯著低于健康魚，血清谷丙轉氨酶（SGPT）、血清乳酸脫氫酶（SLDH）及血清異檸檬酸脫氫酶（SIDH）活性增高。在某些感染魚中，乳酸脫氫酶（SLDH）紊亂，SLDH明顯多出一條區帶[13]。血漿總蛋白、血清總蛋白、尿素氮、膽固醇降低。

草魚出血病毒的危害主要是通過破壞草魚循環系統，減弱草魚血管凝血作用，導致操于體內血清乳酸脫氫酶相對活性的紊亂，這時草魚的生理功能失調，最終各種疾病。此病毒能夠破壞草魚的血液系統降低草魚的血液緩沖系統功能，草魚體內生成大量的固定酸，這些固定酸又不能被及時代謝出去，導致草魚腸道發生病變，減弱其腸道功能，導致草魚體內出現酸中毒。在多種因素的共同作用下，操于體內的一些酶活性受到抑制，導致草魚一些臟器系統法和免疫系統受到較大的影響，比如草魚體內皮質區淋巴細胞減少、壞死等。

3 草魚出血病臨床癥狀

草魚出血病是一種危害性比較大的疾病類型，此病的主要臨床癥狀：初期草魚會有不同程度的食欲不振、頭部發黑，或者草魚背部出現淺白色條帶；隨著病情的加重草魚會出現不同部位的出血癥狀，出血的部位包括頭部、口腔、上下頜、鰓蓋以及腹部等部位，有時也可能表現為眼球突出甚至出現全身肌肉呈鮮紅色、腸壁充血等癥狀[15]；由于魚體嚴重出血，導致貧血的發生，此時鰓絲通常呈灰白色。出血嚴重時，病魚因貧血而使得血液顏色變淡，血量明顯不足，部分臟器顏色也變淡。

以上描述的癥狀主要以出血現象為主，但在實際生產中，發病魚的癥狀并不是上述所有癥狀都會出現，每一條魚的癥狀也各有不同，有時可同時出現兩種，不能將它們絕對地分開，它們之間可同時混合發生。根據中國科學院水生生物研究所長期的觀察結果發現，病魚的主要癥狀可大致劃分為以下三種類型：endprint

紅肌肉型：出現這種癥狀的病魚外表沒有明顯的出血癥狀，即便有出血癥狀也比較輕微，一般病魚肌肉呈點狀或斑塊狀出血，嚴重時全身肌肉呈鮮紅色。因失血過多，鰓絲呈灰白色，此類癥狀一般發生在較小的草魚身上。

紅鰭紅鰓蓋型：這種類型的癥狀一般以體表出血為主，草魚的鰓蓋、口腔、上下頜以及眼部周圍能夠看出有明顯的充血、出血現象，此類癥狀一般發生在較大（13 cm以上）的魚種中出現。

腸炎型：病魚以腸道充血、出血為主，體表及肌肉出血不明顯。嚴重時可見腸道呈鮮紅色，腸系膜脂肪和鰾可見點狀出血。這種類型一般在大小草魚上都可見到。

4 草魚出血病的流行病學特征

草魚出血病之所以那么嚴重，除了其自毒性比較大以外，還有它具有較強的傳染性，該病一旦流行，傳播速度比較快，而且發病時間長，有具有較高的發病率。可造成草魚魚種的大量發病死亡，造成嚴重的損失。可使2.5～15 cm大小的草魚發病，以7～10 cm當年草魚種最為普遍，有時也可使2齡以上的大草魚發病。本病發病率高，死亡率也高，可達70%～80%以上，造成大量草魚種死亡。流行季節在6月下旬至9月底，8月為流行高峰期。一般發病水溫在20～33 ℃，最適發病溫度為27～30 ℃。健康草魚感染此病毒以后，一般在4～15 d內發病死亡，該病病情進展有3個階段，潛伏期、前趨期和發展期[15]。該病毒也可感染青魚、麥穗魚，其它魚未見感染報道。

20世紀50年代初，倪達書等[16]專家就發現草魚出血病伴有出血癥狀，懷疑草魚出血病是一種病毒性疾病。而最早發現草魚出血病是在20世紀70年代的湖北某水產養殖場，當時在湖北、兩廣、江浙等地區非常流行[1]。對于我國草魚出血病的流行情況，陳艷[17]依據2001年和2002年全國草魚出血病病情月報的數據進行分析，草魚出血病主要流行地區為江西、安徽、廣西福建天津等地區。研究結果顯示草魚出血病一年有兩次死亡高峰期，這兩次死亡高峰期分別是每年的7月和9月。草魚病的流行特征在不同地域有相同的流行特點，但是也有一些不同的流行特點，這可能與不同地區自然環境不同有關。而且同地方的同一疾病，在不同流行年份流行特征也有所不同，所以，草魚病的防治結合各個地區自然環境特點等因素進行綜合考慮，總結出發病規律，以便更好開展防治工作。

5 草魚出血病疫苗研究進展

草魚出血病引起草魚魚種大規模的發病，導致魚種大量死亡，對于養殖業所造成的損失是不可估量的。根據人類醫學研究表明，病毒病一直是很難通過藥物起到治療效果，對于草魚出血病更是無有效的藥物進行治療。因此，預防該病的發生顯得尤為重要，近幾年，草魚病的防治重點一直在免疫疫苗的研究。免疫疫苗的防治主要是通過對草魚出血病進行滅活疫苗、減毒疫苗的分析與研究，發揮其免疫效果作用。而且隨著生物學的發展，疫苗免疫保護效果的研究越來越完善[18]。下面對上述幾種疫苗的優缺點以及免疫保護效果作簡要的評價。

5.1 滅活疫苗

滅活疫苗的主要機理是利用某種高科技方法滅活草魚病原體的感染性蛋白[19]，如利用滅活劑或者加熱處理方式在不改變草魚原有免疫系統功能的情況下殺死草魚活病原微生物。其優點是研制周期短，制備方便，使用安全，易于保存。其缺點是需要有大量的病毒基礎才能引起免疫應答作用。而大量病毒又可能引起草魚局部或全身的不良反應[20]；另外，該疫苗由于不能進入MHC I類抗原呈遞途徑，所以在實際使用過程中也很難達到消耗的效果，即便有較好的效果，但是效果比較短暫[21]。

5.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過化學或物理的方法，使得病原體的毒力單位活性減低，但又不丟失其具有免疫原性的一類疫苗，通常具有較好的免疫原。優點是該病毒的繁殖能夠在宿主體內進行，這樣就減少了在草魚體內注佐劑的環節，不會影響草魚肉的品質，而且此疫苗免疫期比較長。缺點是在使用此種免疫疫苗進行處理過程中存在一定的致病性，如果刺激性過強會有一定程度的潛在危險性；同時，這種活疫苗的生產對周圍環境有一定的影響；而且這種免疫疫苗不便于儲存，保質期比較短，一般情況下需要凍干保存。所以這種免疫疫苗應用成本比較高，影響其在發展中國家的推廣應用。許淑英等[20]對該疫苗進行研究，研究結果顯示，此類疫苗的應用能夠實現100%草魚成活率和免疫保護率。

5.3 基因工程疫苗

此類免疫疫苗主要是通過重組草魚DNA進行的治療，DNA重組技術應用于草魚身上能夠使草魚產生優質抗原。在醫學上大家普遍認為所謂理想的疫苗必須具備安全、穩定、低價，并且含有兩種或者兩種以上的保護性免疫原，而且口服一次既能產生良好的效果的疫苗。目前，研制的免疫疫苗中仍然沒有一種疫苗能夠完全符合以上全部條件，所以基因疫苗越來越被人們所關注。基因疫苗比傳統疫苗具有較多的優點，這些優點主要表現在：一是草魚接種基因疫苗以后，抗原蛋白在草魚細胞內加工處理與病原的自然感染過程相似，而且他們的抗原呈遞過程也比較相似，所以能夠在草魚體內誘導機體產生免疫功能；二是免疫疫苗的抗原基因能夠在草魚體內存活較長的時間，抗原蛋白能夠持續提供給免疫系統刺激，刺激草魚機體產生持久性的免疫應答；三是基因工程疫苗能夠將同抗原基因的質粒混合，以便達到聯合免疫作用，提高免疫效果；四是這種免疫疫苗沒有免疫原性，能夠反復利用，成本比較低。

總之，基因疫苗比其他形式的免疫疫苗具有較強的抗原性，保質期比較長，制作工藝簡單，運輸方便，成本廉價，是一種全新的草魚病毒免疫方式，受到越來越多國家和地區漁民的青睞。但是基因工程疫苗中抗原基因的選擇對疫苗的免疫效果有重要的影響。

5.3.1 重組亞單位疫苗

這種疫苗技術主要是利用重組DNA技術將抗原基因進行體外表達，使病原機體產生病源蛋白，利用病源蛋白的免疫保護性功能達到免疫應答作用。其優點是副作用少，不易致癌及回復突變，疫苗是通過直接合成。但是其制備過程復雜，成本較高，技術要求也高。方勤等對重組亞單位疫苗進行研究，研究結果顯示，重組病毒不僅能夠也構建表達VP6的重組病毒，而且能夠獲得一定的蛋白表達。這項研究為基因工程疫苗的研究與開發奠定了基礎。endprint

5.3.2 DNA疫苗

DNA疫苗是將魚體內部注射一定量的某種蛋白質抗原重組真核表達載體，以便使草魚體內形成活體免疫系統，起到誘導免疫細胞應答的作用。這種疫苗與傳統疫苗相比具有一定的穩定性高、安全性高、免疫全面、生產規模大等特點，被人們稱為繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的新一代疫苗。徐詩英等將草魚呼腸孤病毒（GCRV）外衣殼蛋白VP7雙基因（約0.9 kb）及團頭魴的β-肌動蛋白啟動子（約0.56 kp）的研究。研究結果顯示接種適當劑量的該疫苗能起到100%的免疫保護效果。為基因工程疫苗的進一步開發奠定了基礎。

6 我國商品化疫苗研究

對于我國草魚出血病商品化疫苗的研究，前幾年，中國水產科學研究院研發的草魚出血病活疫苗（GCHV-892 株）獲得新獸藥證書，標志著草魚出血病活疫苗國內外首個研制成功，自此草魚出血病活疫苗研究與應用得到了進一步發展。早在20世紀60年代我國就研制出了水產疫苗草魚出血病組織漿滅活疫苗-土法疫苗后。20世紀90年代我國研制出免疫效果好、保護期長等優點的高效弱毒疫苗，該疫苗的研制是通過天然活性物質對草魚病毒進行降毒、減毒處理。該疫苗具有較多的優點，如便于儲存、使用方便等，此疫苗應用一次就能起到較好的免疫功能，此疫苗經過在兩廣、江浙等地區應用試驗，能夠達到90%的免疫保護率。

7 草魚出血病防治研究展望

草魚出血病是一種更嚴重的病毒性魚病，對草魚的危害性比較大，發病率和死亡率在80%以上，這種病在水溫20～30 ℃時最為流行，尤其是在水質條件差，水中各種氮和有機抗氧量偏高的情況下最易流行。病毒一旦流行開開很難遏制，一般健康草魚染病后7～15 d就會出現嚴重癥狀以及死亡，而且此病毒具有較高的傳染性。目前，藥物治療沒有較好的治療效果。我國對草魚出血病的治療研究主要集中在免疫疫苗治療方面，并取得了教好的治療效果。

首先，草魚出血病的病原主要存在魚體活組織細胞內而形成的大量治病病毒，對于病毒的治療如果采用化學藥物療法，藥物很難侵入被病毒感染的組織細胞內部，即便能夠侵入病毒組織細胞含量也不高，很難對病毒產生具有威脅力的殺傷性，療效不高。其他藥物也很到起到較好的防病毒藥物，目前，對草魚出血病只能采取一些預防性措施，或者通過免疫系統增加草魚計提的免疫功能來達到防止病毒入侵的效果；再或者是改變草魚的生長環境，人為制造不利于病毒繁殖的環境。其中，采用免疫法提高草魚機體的抗免疫能力，一次達到預防病毒入侵的效果，這是目前治療和預防草魚出血病的主要方式。免疫疫苗能夠較好的預防草魚出血病的發生，在防治草魚出血病病毒繁殖與復制方面具有較好的效果。

另外，還有一種預防草魚出血病發生的有效方式——干擾素，干擾素是一種細胞調節因子，它具有較好的抗病毒、抗腫瘤功能，而且具有免疫調節功能，用于草魚出血病的防治具有較好的治療效果。邵健忠等對曾經專門對某種干擾素進行分析，研究結果顯示此干擾素能夠激活草魚機體內的巨噬細胞，提高草魚巨噬細胞的吞噬以及抗病毒能力。錢凱先等研究結果顯示，人工誘導干擾素對草魚出血病的防治具有較好的效果。

近代以來，不管是我國還是世界上其他國家對草魚出血病毒的研究都從未間斷，從目前的研究結果來看，免疫預防對防治草魚病比其他治療形式具有較好的治療效果。這主要是因為免疫增強劑能夠提高草魚機體免疫功能，提高草魚抗病毒和抗感染能力。而且免疫疫苗在作用時免疫增強所需要的時間比較短，持續的效果比較長，是目前提高魚體免疫活性，增強草魚抵抗力最為有效的方法，在草魚出血病的預防與治療中具有重要的應用價值。

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（責任編輯：趙中正）endprint