唾液作為口腔癌癥診斷的研究進展

王冠勛，李正強，尤 琦，李佳樂，王梓霖，韓 冰

(吉林大學口腔醫學院口腔頜面外科，吉林 長春 130021)

唾液作為口腔癌癥診斷的研究進展

王冠勛，李正強，尤 琦，李佳樂，王梓霖，韓 冰

(吉林大學口腔醫學院口腔頜面外科，吉林 長春 130021)

利用唾液進行疾病的診斷和檢測是一種很有前景的方法，在過去的20年里，學者們將唾液生物標記物作為口腔癌癥早期診斷方法，并找到了超過100種的唾液生物標記物，但仍存在一些問題需要進一步研究。本文對唾液生物標記物作為口腔癌癥(口腔鱗狀細胞癌)診斷的研究進展做一綜述。

口腔癌；唾液；生物標記物

口腔癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其發病率為3%，在全身癌癥中排名第六，5年存活率為62%，90%的口腔癌屬于上皮源性的鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)[1]。大多數OSCC發病后在口腔內可以找到明顯的癌變組織，但是由于各種原因往往確診時病程已經進入了晚期階段(T3-T4)，嚴重影響了口腔癌的預后。學者們通過研究發現，唾液中含有許多成分可以反映出病理狀態下的人類代謝水平，唾液中的生物標記物可以作為早期診斷OSCC的依據[2-3]。目前在唾液中已經發現了100多種可能作為診斷OSCC的潛在生物標記物[4]。本文旨在通過回顧目前相關領域的研究進展，對唾液生物標記物作為口腔癌癥(口腔鱗狀細胞癌)的診斷研究進行探討。

1 唾液的成分及功能

唾液是由腮腺、頜下腺、舌下腺及許多小黏液腺分泌的，pH值為6.4～7.4，其成分包括水、無機鹽、有機物、蛋白、激素等。唾液具有潤滑黏膜、消化食物、抗菌活性、牙釉質的再礦化和維護正常的味覺等功能[5-6]。目前在唾液中已發現2 300多種蛋白質和多肽，其中含量較多的蛋白質是α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、乳鐵蛋白、粘蛋白、溶菌酶等，其中富酪蛋白和轉鐵蛋白占唾液總蛋白的98%[7-8]。

2 口腔癌患者唾液中的生物標記物及其研究方法

與其他惡性腫瘤相比，唾液可以直接接觸到OSCC的病灶部位，因此唾液中的生物標記物成為了首選的診斷口腔癌癥的生物樣品來源。在以往的研究中，學者們證實OSCC患者唾液中的DNA、mRNA、酶、細胞因子、生長因子、基質金屬蛋白酶、端粒酶、細胞角蛋白等已發生改變[9]。Liao等[10]在2000年首先提出了唾液對口腔癌癥的診斷意義，62.5%的口腔癌患者唾液中的DNA外顯子4和p53基因第63位密碼子發生突變，在患者的血清中還檢測到了基因突變后表達異常的p53蛋白經體液免疫產生的相應抗體，同時在口腔癌患者的基因中存在著雜合性丟失(Loss of heterozygosity，LOH)，且LOH的發生率普遍高于基因突變的發生率。

Bahar等[11]研究發現，與健康人相比OSCC患者唾液中活性氮的含量顯著增高，而唾液中抗氧化劑則顯著降低。增高的活性氮直接導致了唾液中抗氧化劑的減少，使蛋白和DNA氧化并導致癌癥。Sato等[12]研究發現OSCC患者唾液中白細胞介素(IL-6)與腫瘤壞死因子(TNF-α)顯著增高，IL-6能抑制p53腫瘤抑制基因的啟動子區使其失活，導致細胞的增殖與凋亡失去控制；TNF-α則激活NFjB轉錄因子增殖，阻止細胞凋亡并促進炎性細胞因子的分泌。Zhong等[13]研究發現在OSCC患者唾液中有75%的端粒酶表達，認為人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)可能是一個潛在的生物標記物，端粒酶是由核糖核蛋白在其編碼染色體末端增加重復序列編碼而來，端粒酶的活化可能導致正常細胞向惡性細胞的轉變。

口腔癌中存在的細胞、分子異質性以及大量潛在的致癌基因足以說明了運用蛋白質組學研究其基因表達變化的重要性。隨著基因組學和蛋白質組學的不斷發展以及質譜技術的提出，口腔癌患者唾液中生物標記物的鑒別也得到了進一步的發展。Carvalho等[14]通過免疫方法成功的從唾液中提出了5種可能的生物標記物：Mac-2結合蛋白(M2BP)、髓系相關蛋白質14(MRP14)、CD59、前纖維蛋白1和過氧化氫酶。蛋白質組學定量分析技術發現，在癌癥患者唾液樣本中肌動蛋白和肌凝蛋白的含量均高于正常人水平[15]，并證實二者就是唾液中的生物標記物[16]。而轉鐵蛋白及腫瘤特異性DNA也可能成為口腔癌早期診斷中有效的生物標記物。有文獻指出了唾液中的一些mRNA可作為口腔癌生物標記物，包括雙特異性磷酸酶1(DUSP1)、編碼組蛋白H3F3A、IL-1B、IL-8、鳥氨酸脫羧酶抗酶I(OAZ1)、亞精胺/精胺N1-乙酰轉移酶1(SAT)、S100鈣結合蛋白P(S100P)等。Zhong等[17]也鑒定出了一些生物標記物，包括4個轉錄子組(IL-8、IL-1B、SAT1、S100P)和3種蛋白(IL-1B、IL-8、M2BP)，這些物質在癌癥患者唾液中的含量明顯高于正常人。學者們對基因多態性進行研究發現，IL-6、IL-8、TNF-α、血管內皮生長因子(VEGF)、細胞色素p4501A1(CYP1A1)、谷胱甘肽S-轉移酶T1(GSTT1)、谷胱甘肽S-轉移酶M1(GSTM1)與癌癥的進展有關[18]。唾液中含有大量的基因組信息，且較傳統的分析物如血液、病變組織更方便易得，因此唾液將有望成為口腔癌癥基因篩選的有利途徑。

3 OSCC患者唾液中生物標記物研究面臨的問題和挑戰

3.1 唾液樣品的收集、處理和存儲缺乏明確的標準 到目前為止，已經有文獻報道超過100多種OSCC患者唾液中的生物標志物，但唾液樣品的收集處理和儲存沒有標準化的流程，比如在采集前要求患者采用標準的飲食或使用標準的口腔清潔制劑。這使得這些生物標記物在不同的條件與實驗狀態下得出的研究結果的可信度讓人懷疑，其重復性欠佳。比如有一些生物標記物由于樣品的收集和處理方法不同，學者們得出了不同的結果。目前已經有學者在制備更可靠的標準化產品來迎合市場的需求，使未來通過唾液來診斷口腔癌癥將得以實現。

3.2 唾液中生物標志物的可靠性 在不同的唾液生物標記物研究中，生物標記物的含量變化范圍很大，缺乏一個合理的標準來進行規范。唾液中IL-6和IL-8是兩種目前研究最多的生物標記物[19-21]，它們不僅僅是潛在口腔癌的檢測物質，同時也作為監測慢性牙周炎和扁平苔癬等疾病活動的指數，其中扁平苔癬是一種影響著世界2%人群的慢性黏膜炎性疾病。在多種不同的研究中，健康人IL-6的變化范圍就從(1.4±0.9)pg/ml到(47.46±18.74)pg/ml，而IL-8的范圍從250 pg/ml]到(1945±181)pg/ml[22-24]。如果不同研究中IL-6和IL-8的濃度變化如此之大，人們就很難確定IL-6和IL-8的標準來說明OSCC的進展。

在上述研究中，相同的唾液組成成分在不同的研究中存在大幅度的變動，很大程度上是由于處理方法的不同，也有可能是由于物質本身的生物學變化。一些學者通過對OSCC患者唾液中潛在的特定蛋白質與健康成人中mRNA生物標記物的研究，已經對唾液的蛋白質組中物質內部與物質間的變化做出了相關報道。在臨床試驗研究中，生物樣品自身的生物學變化嚴重阻礙了標準化的確定[25]。唾液中成分的變化受種族、地理位置、年齡、性別、飲食習慣、非腫瘤系統疾病、治療藥物等因素影響。例如，血漿內皮素1是OSCC患者唾液中潛在的生物標記物，然而患有充血性心衰或上消化道疾病如胃潰瘍和胃炎等患者的唾液中血漿內皮素1的含量也明顯增高[26]。目前還報道了唾液中某些蛋白的含量隨年齡增長變化明顯，但還未作為測定OSCC唾液中的潛在生物標記物。綜上所述，這種物質內部和物質間的變化急需更多的相關研究來解釋物質自身的生物學變化，從而為OSCC唾液中的生物標記物制定和完善提供合理的參考范圍。

3.3 OSCC患者唾液中的生物標記物的進一步認證 在理想狀態下，一個良好的臨床檢測方法應該具有較高的靈敏度和特異性?？谇粌鹊沫h境常常受到各種因素的干擾，如炎癥、外傷、牙菌斑、感染或者黏膜病損等。在各種復雜的條件影響下OSCC患者唾液中的生物標記物會受到何種影響目前未見到相關的報道[27]。大多數的研究并沒有將這部分問題考慮在內，所以其結果不能排除這些因素的干擾，導致某些假陽性結果。這使得臨床上通過唾液診斷OSCC尚難以實現。例如，IL-6、IL-8、IL-1β、堿性成纖維細胞生長因子、氧化應激分子等不僅是已知的OSCC患者唾液中的生物標記物，同時它們也參與炎癥反應與創口愈合過程，并且在口腔扁平苔蘚、牙周炎患者中其檢測水平也與正常人不同。所以找到一種OSCC患者獨特的生物標記物，增加其臨床可靠性是臨床迫切需要解決的問題。

4 展望

將唾液生物標記物應用于口腔癌癥的早期診斷具有許多獨特的優勢，但是一些潛在的問題(如唾液的樣本采集、處理和儲存方法；其結果的可靠性；與其他慢性疾病或其他惡性腫瘤相區別的特異性標記物的確定；口腔內環境的改變導致其生物標記物變化等)還有待進一步的研究。如果想將該方法進入臨床階段，勢必市場上需要出現標準化的處理方法及標準試劑?？傊僖荷飿擞浳飳τ诳谇话┑脑缙谠\斷具有很大的潛力，將有可能成為未來對于口腔癌癥診斷、檢測疾病進展的新方法。

[1]鄭家偉,李金忠,鐘來平,等.口腔鱗狀細胞癌臨床流行病學研究現狀[J].中國口腔頜面外科雜志,2007,5(2):83-90.

[2]Cheng Y,Wright J.Advances in diagnostic adjuncts for oral squamous cell carcinoma[J].The Open Pathology Journal,2011,5:3-7.

[3]Nikitakis NG,Sarlani E,Kolokythas A,et al.Frequency of pain and correlation with clinical and histologic parameters in t1 squamous cell carcinoma of the tongue:a retrospective pilot study[J].Journal of Oral&Facial Pain and Headache,2013,28(1):46-51.

[4]Castagnola M,Picciotti PM,Messana I,et al.Potential applications of human saliva as diagnostic fluid[J].Acta Otorhinolaryngol Ital, 2011,31(6):347-357.

[5]Chiappin S,Antonelli G,Gatti R,et al.Saliva specimen:a new laboratory tool for diagnostic and basic investigation[J].Clin Chim Acta,2007,383(1-2):30-40.

[6]Jou Y J,Hua CH,Lin CD,et al.S100A8 as potential salivary biomarker of oral squamous cell carcinoma using nanoLC-MS/MS[J]. Clinica ChimicaActa,2014,25(436):121-129.

[7]Messana I,Inzitari R,Fanali C,et al.Facts and artifacts in proteomics of body fluids.What proteomics of saliva is telling us?[J]. J Sep Sci,2008,31(11):1948-1963.

[8]B?l?nescu,P,L?daru A,B?lanescu E,et al.Systemic sclerosis biomarkers discovered using mass-spectrometry-based proteomics:a systematic review[J].Biomarkers,2014,19(5):345-355.

[9]Momen-Heravi F,Trachtenberg AJ,Kuo WP,et al.Genomewide study of salivary microRNAs for detection of oral cancer[J].Journal of Dental Research,2014,93(7 suppl):86S-93S

[10]Liao PH,Chang YC,Huang MF,et al.Mutation of p53 gene codon 63 in saliva as a molecular marker for oral squamous cell carcinoma [J].Oral Oncol,2000,36:272-276.

[11]Bahar G,Feinmesser R,Shpitzer T,et al.Salivary analysis in oral cancer patients:DNA and protein oxi-dation,reactive nitrogen species,and antioxidant profile[J].Cancer,2007,109:54-59.

[12]Sato J,Goto J,Murata T,et al.Changes in saliva interleukin-6 levels in patients with oral squamous cell carcinoma[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2010,110:330-336.

[13]Zhong LP,Chen GF,Xu ZF,et al.Detection of telomerase activity saliva from oral squamous cell carcinoma patients[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2005,34:566-570.

[14]Carvalho AL,Jeronimo C,Kim MM,et al.Evaluation of promoter hypermethylation detection in body fluids as a screening/diagnosis tool for head and neck squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(1):97-107.

[15]Brinkmann O,Kastratovic DA,Dimitrijevic MV,et al.Oral squamous cell carcinoma detection by salivary biomarkers in a Serbian population[J].Oral Oncol,2011,47(1):51-55.

[16]Jou YJ,Lin CD,Lai CH,et al.Proteomic identification of salivary transferrin as a biomarker for early detection of oral cancer[J].Anal ChimActa,2010,681(1:2):41-48.

[17]Zhong L,Chen G,Xu Z,et al.Detection of telomerase activity in saliva from oral squamous cell carcinoma patients[J].Int J Oral and Maxillofac Surg,2005,34:366-370.

[18]Shpitzer T,Bahar G,Feinmesser R，et al.A comprehensive salivary analysis for oral cancer diagnosis[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2007,133(9):613-617.

[19]杜 娟,顏雨春.口腔鱗狀細胞癌患者唾液中CEA、IL-6、IL-8含量的檢測[J].安徽醫科大學學報,2010,45(4):579-581.

[20]Malpass GE,Arimilli S,Prasad GL,et al.Complete artificial saliva alters expression of proinflammatory cytokines in human dermal fibroblasts[J].Toxicological Sciences,2013,134(1):18-25.

[21]Dafar A,Rico P,Isik A,et al.Quantitative detection of epidermal growth factor and interleukin-8 in whole saliva of healthy individuals[J].Journal of Immunological Methods,2014,408:46-51.

[22]Rhodus NL,Ho V,Miller CS，et al.NF-kappaB dependent cytokine levels in saliva of patients with oral preneoplastic lesions and oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Detect Prev,2005,29(1): 42-45.

[23]Leeman-Neill RJ,Seethala RR,Singh SV,et al.Inhibition of EGFR-STAT3 signaling with erlotinib prevents carcinogenesis in a chemically-induced mouse model of oral squamous cell carcinoma [J].Cancer Prevention Research,2011,4(2):230-237.

[24]Motamedi S,Shilagard T,Edward K,et al.Gold nanorods for intravital vascular imaging of preneoplastic oral mucosa[J].Biomedical optics express,2011,2(5):1194-1203.

[25]Fraser CG.Inherent biological variation and reference values[J]. Clin Chem Lab Med,2004,42(7):758-764.

[26]Denver R,Tzanidis A,Martin P,et al.Salivary endothelin concentrations in the assessment of chronic heart failure[J].Lancet,2000, 355(9202):468-469.

[27]Mankan AK,Lawless MW,Gray SG，et al.NF-kappaB regulation: the nuclear response[J].J Cell Mol Med,2009,13(4):631-643.

R739.8

A

1003—6350（2015）06—0857—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0305

2014-09-02)

韓 冰。E-mail：569869924@qq.com