血管內皮細胞衰老的研究進展

王 雪，石志平（綜述），徐志芳，周亞茹（審校）

（河北醫科大學第三醫院內分泌科，河北 石家莊050051）

近年來，隨著對血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）生物學功能認識的不斷深入，對動脈粥樣硬化等血管相關疾病發病機制的研究重點逐漸轉向VEC功能障礙。VEC是覆蓋于血管內膜表面的單層扁平鱗狀上皮細胞，其構成血管壁的生物屏障，具有多種生物學功能。內皮細胞衰老可導致血管功能障礙，是多種血管性疾病發生的始動因素。了解VEC衰老的相關機制，可以指導臨床相關疾病的治療。現就VEC衰老及其相關機制綜述如下。

1 VEC簡介

VEC為襯貼于血管腔表面的扁平鱗狀上皮細胞，呈單層縱向排列，是人體最大的組織；其生物學功能多樣，可構成血流與血管壁之間的選擇性通透屏障，具有調節血管通透性和血管張力，維持凝血功能平衡，感受血管應切力，對細胞損傷作出反應，分泌多種活性物質等作用。

VEC衰老主要包括細胞復制性衰老和應激誘發的細胞早衰2種方式。因細胞基因異常（如各種類型的DNA損傷）引起的細胞分裂停止稱為細胞復制性衰老；體外培養的細胞在沒有受到任何應激和損傷的條件下，經過一系列的傳代之后，逐漸衰老，即復制性衰老。細胞受到某些外界因素的影響而造成永久的、不可逆轉的增殖停滯，則稱為早衰；應用高糖、腫瘤壞死因子等處理體外培養的細胞，即可誘導細胞早衰。

體外培養的VEC發生衰老后，形態學上表現為細胞間間隙增寬，細胞扁平、寬大，細胞核和核仁體積增大。內皮依賴的血管舒張和收縮因子、抗氧化因子、凝血因子等表達水平發生變化，導致內皮細胞功能障礙，影響血管功能。研究證實，體外培養的人臍靜脈內皮細胞發生衰老后，其一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）和內皮 NO 合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的活性降低［1］。在衰老的細胞中，活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）的產生顯著升高，過高濃度的ROS可降低NO的生物利用度，增加過氧硝酸鹽的生成。

2 內皮細胞衰老的相關機制

目前認為，很多系統性疾病，如高血壓、冠心病、糖尿病等均與VEC衰老、損傷有關；一些刺激因素，如吸煙、放射性損傷等均可引起內皮細胞衰老性改變，雖然不同因素對內皮細胞的作用機制各不相同，但最終都進入細胞衰老的共同途徑。

2.1 線粒體膜電位、活性氧自由基與內皮細胞衰老

線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是三大營養物質最終氧化釋放能量的場所，是細胞中重要的細胞器。線粒體跨膜電位的形成主要依賴于內膜上電子傳遞鏈中的復合體Ⅰ，它能在電子傳遞過程中把質子泵出內膜外，起到質子泵的作用，從而形成內膜外的高pH化學勢能和高濃度質子電位勢能，形成線粒體跨膜電位的基礎［2］。線粒體跨膜電位降低是細胞凋亡早期的不可逆事件。細胞內絕大部分ROS由線粒體代謝產生，ROS具有多種生理功能，如調節細胞內信號分子傳導途徑，穩定血管結構和功能，介導體內單核細胞遷移、分化以及巨噬細胞分泌細胞因子等，生理濃度的ROS是維持細胞正常生理活動所必需的，而ROS濃度過度增高可以誘導DNA損傷［3］，導致突變，最終引起細胞死亡。趙海梅等［2］觀察到，人臍靜脈內皮細胞在傳代導致的復制性衰老過程中，線粒體膜電位降低，線粒體受損。細胞受損早期ROS產生增加，但在細胞受損晚期，線粒體嚴重受損、功能嚴重退化，ROS產生降低。Gardner等［4］用含有患外周血管疾病患者血清的培養基培養內皮細胞，結果顯示，實驗組內皮細胞中產生的ROS比對照組高62%，細胞凋亡量比對照組高64%，且實驗組內皮細胞的抗氧化能力下降。

ROS導致內皮細胞衰老的機制主要為：氧化應激時，細胞不斷產生ROS，但機體對其清除率下降，造成ROS堆積，后者大量降解NO，導致NO生物活性降低甚至消失，引起血管舒張功能障礙。

此外，ROS可通過多種途徑誘導內皮細胞凋亡：①可直接或間接激活NF-κB，被激活的NF-κB轉位進入細胞核與多種凋亡相關基因結合，促進基因轉錄，誘導細胞凋亡；②ROS破壞線粒體內膜，促進細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）釋放到細胞漿，胞漿中的Cyt-C與凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activating factor-l，Apaf-I）、dATP或ATP結合，促進Apaf-I構象變化并使其發生同源寡聚化。Apaf-I通過與凋亡蛋白procaspase-9結合使procaspase-9募集，并通過與dATP、Cyt-C組成聚合體，進一步激活procaspase-9，后者促使Cyt-C結合Apaf-1和dATP，進而激活下游的凋亡蛋白procaspase-3，最終進入內源性和外源性凋亡途徑的最后通路，引起內皮細胞凋亡；③ROS還可以通過誘導VEC黏附分子的表達，加重局部炎癥反應，損傷內皮細胞。

2.2 端粒與VEC衰老 端粒是線狀染色體末端的DNA重復序列，具有保護染色體、維持遺傳系統穩定的作用。在正常人體細胞中，端粒可隨著細胞分裂而逐漸縮短，嚴重縮短的端粒是細胞老化的信號。端粒具有特殊的三維結構-T環，當端粒縮短到一定長度時，將不能形成正常的三維結構，導致染色體失去穩定性，發生畸變、斷裂或缺失，細胞分裂停止，細胞進入衰老和死亡。

端粒酶由人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）、端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相關蛋白（TP）三部分組成，是一種逆轉錄酶。端粒酶通過自己的RNA模板、催化亞單位、輔助蛋白，將端粒DNA加到染色體末端，起到維持端粒序列長度，修復受損染色體末端的作用［5］。因此，端粒酶在VEC衰老過程中起著重要的作用。研究表明，某些因素可通過上調磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3kinase，PI3K）／Akt通路，促進 Akt磷酸化，增加端粒酶活性，使hTERT基因過表達和相應部位磷酸化，在內皮細胞中起著抗衰老、抗氧化應激的作用。因此，端粒酶是Akt途徑中的一個重要下游底物［6］。Guan等［7］用0.5Gy劑量的X線持續照射體外培養的人臍靜脈內皮細胞，結果顯示，與對照組相比，受照射組細胞的平均末端限制酶片段（the terminal restriction fragment，TRF）長度變短，較長的端粒（9.4～4.4 kb）百分比有減少的趨勢，最短的端粒（4.4～2.3 kb）百分比顯著增加，此外，受照射組的細胞增殖受到抑制，凋亡率持續維持在高水平。表明縮短的端粒對VEC衰老、凋亡起到促進作用。González-Guardia等［8］研究顯示，擁有較長端粒的人群，其血漿IRH和NO水平更高，但血漿GPx和SOD活性降低。表明端粒磨損造成內皮功能障礙。

2.3 microRNAs（miRNAs）調控 VEC衰老

miRNAs是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小約20～25個核苷酸，在真核細胞中調節基因的表達。miRNAs在細胞生長和凋亡、血細胞分化、胰島素分泌等過程中發揮重要作用。在內皮細胞衰老中起作用的miRNAs主要包括miR-34a、miR-200c、miR-217和 miR-146a。研究顯示，miR-34a通過作用于其靶基因沉默信息調節因子2相關酶l（silent mating type information regulation 2homolog 1，SIRT1），發揮調節細胞增生和發育的作用。SIRT與染色體末端的失活有關，可以延緩抑制衰老［9］。研究發現，miR-34a在衰老細胞中的表達水平明顯升高，VEC中過表達的miR-34a，使得SIRT1的表達水平降低［10］，腫瘤抑制蛋白p53的乙酰化程度增加，乙酰化的p53以正反饋方式顯著提高 miR-34a的表達［11］，最終促進細胞衰老；miR-200c通過調控其下游信號通路的靶基因p21的表達水平，促進細胞早衰。miR-217［12］是SIRT1的內源性抑制劑，通過抑制SIRT1的轉錄后翻譯過程，影響其下游信號通路分子eNOS和叉頭轉錄因子1（forkhead box protein O1，FoxO1）的乙酰化。eNOS乙酰化后可導致其活性降低，降低細胞內NO的生成，使活性氧自由基濃度增加，進而促進細胞衰老，而乙酰化的FoxO1促進細胞凋亡。研究表明，下調miR-146a的表達，導致其對NADPH氧化酶4的靶向抑制作用降低［13］，最終可促進細胞出現衰老表型。Che等［14］通過微陣列分析法研究miRNAs，誘導的血管內皮細胞衰老過程中的變化。研究顯示，衰老組細胞miR-125a-5p的表達比對照組高2.9倍。免疫印跡分析顯示，衰老組細胞miR-125a-5p的靶蛋白轉錄相關增強因子1（related transcriptional enhancer factor-1，RTEF-1）的表達水平低于對照組。在對照組VEC中應用pre-miR-125a-5p使miR-125a-5p過表達，可以下調RTEF-1、eNOS、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促進VEC發生衰老改變；相反，在衰老組細胞中抑制miR-125a-5p的表達，可以上調RTEF-1、eNOS、VEGF，延緩衰老。雙熒光素酶報告基因分析法顯示，RTEF-1是miR-125a-5p的直接靶點，miR-125a-5p通過抑制RTEF-1的表達和調節eNOS、VEGF的表達，調控VEC的生長。但敲除RTEF-1基因引起的VEC衰老不能被抑制miR-125a-5p的表達緩解。

2.4 CYP4A-20-HETE通路與VEC功能失調

20-羥-二十 烷 四 烯 酸 （20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）細胞色素P-450代謝途徑的一個重要代謝產物。近年來研究發現，20-HETE對VEC發揮重要的生理和病理生理作用。CYPω-羥化酶被發現是20-HETE的合成酶，其中CYP4A和CYP4F是催化AA合成20-HETE的主要ω-羥化酶。人體中，主要的20-HETE合成酶是CYP4A11、CYP4F2和CYP4F3；大 鼠 中 主 要 是 CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3和CYP4A8；小鼠中主要是CYP4A10、CYP4A12、CYP4A14和CYP4F14。

研究表明大鼠過表達CYP4A2，或應用20-HETE合成酶的誘導劑DHT，均可顯著升高CYP4A和20-HETE的表達，20-HETE通過激活NADPH氧化酶通路，使得超氧陰離子的生成增多，進而誘導VEC的氧化應激損傷，使NO的生物利用度降低，最終引起VEC功能失調。

研究證實，20-HETE可以抑制eNOS與熱休克蛋白（heatshock protein 90，HSP90）的結合，使eNOS的激活受到抑制，從而導致NO的釋放顯著降低，超氧陰離子的生成顯著增加［15］。此外，20-HETE還可通過AMPK途徑，使eNOS解聚，從而減少NO的生成，最終導致內皮細胞功能失調［16］。

2.5 表觀遺傳與內皮細胞衰老 表觀遺傳是指基于非基因序列改變所致的基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等。研究認為，表觀遺傳學通過調節Ki-67基因的表達，影響VEC的功能。研究證實，短肽vesugen與D-7通過作用于Ki-67基因啟動子區域的5′-AGCCTCAACCATCAGGAAAACAAGAGT-3′序列，降低Ki-67基因的表達，對老年人的血管起到保護作用。組織因子是參與止血和腫瘤進展的重要跨膜蛋白。Kurz等［17］利用染色質免疫沉淀法觀察到，組蛋白H3乙酰化降低導致組織因子染色質重構，使得衰老的細胞對組織因子失去誘導能力，未衰老的細胞中端粒酶逆轉錄酶可逆轉染色質的這種改變，延緩細胞衰老。Wan等［18］在體外培養的人臍靜脈內皮細胞中高表達SIRT1，表現出抗衰老的效應，體內試驗也證實，高表達SIRT1使得小鼠主動脈內皮細胞的功能得到提高，改善了動脈僵硬度。進一步研究表明，SIRT1能夠綁定到纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的啟動子區域，導致這一區域的組蛋白H4賴氨酸16（histone H4lysine 16，H4K16）的乙酰化受阻，PAI-1表達受到抑制。SIRT1介導的這種表觀遺傳下調PAI-1的表達，可阻止VEC復制性衰老。

2.6 PI3K／Akt通路調控VEC衰老 PI3K／Akt信號通路可以影響多種下游效應分子的活化狀態，發揮抑制凋亡、促進增殖的作用，是細胞內重要的信號轉導通路之一。Li等［19］用含有血管緊張素2的培養基體外培養人臍靜脈內皮細胞1周，結果顯示，血管緊張素2呈劑量依賴性，使線粒體膜電位去極化，增加ROS產生，顯著增加TERT、解耦連蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）、Akt、p-Akt、p53等蛋白的表達水平，加速細胞衰老程度。PI3K抑制劑LY294002可減緩其誘導的內皮細胞衰老及凋亡。表明血管緊張素2通過PI3K／Akt／UCP2途徑誘導VEC衰老。

此外，內皮細胞衰老的一個特點是促炎基因的持久上調。Ito等［20］發現，CDC42通路與內皮細胞衰老相關的慢性炎癥有關。抑制CDC42或NF-κB通路可減弱人內皮細胞促炎基因的表達。內皮特異性激活p53、p21途徑，也可以上調促炎基因的表達，這種作用可以通過敲除內皮細胞中的cdc42基因得以逆轉。Zhu等［21］的研究證實，活性高分子量激肽酶原通過JNK／FOXO4／MnSOD途徑促進內皮祖細胞衰老。

綜上所述，VEC衰老導致的血管功能障礙，是多種心血管疾病的共同病理基礎。目前，內皮細胞衰老的確切機制尚不明確，深入研究內皮細胞衰老的機制，可為未來臨床防治心血管相關疾病提供新思路。

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