懸浮紅細胞對CD4+CD25+Treg細胞分化的影響

趙學濤，楊從容，任曉亮，李　明，解曉元，巨紅妹

(1.河北醫科大學第四醫院輸血科，河北 石家莊 050011；

2.河北醫科大學第四醫院放療科，河北 石家莊 050011)

·論著·

懸浮紅細胞對CD4+CD25+Treg細胞分化的影響

趙學濤1，楊從容2，任曉亮1，李明1，解曉元1，巨紅妹1

(1.河北醫科大學第四醫院輸血科，河北 石家莊 050011；

2.河北醫科大學第四醫院放療科，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的體外觀察懸浮紅細胞對異體T淋巴細胞向CD4+CD25+Treg細胞分化的影響。方法采用Ficoll密度梯度離心法和免疫磁珠法從人外周血中分離純化出CD3+T淋巴細胞，給予CD3/CD28抗體刺激，并分別與異體非去白懸浮紅細胞或去白懸浮紅細胞混合培養72 h。采用流式細胞儀檢測各組培養體系中CD4+CD25+Treg細胞的比例。采用實時熒光定量PCR檢測各組Foxp3 mRNA的表達情況。采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組細胞上清中促炎細胞因子[白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)]和抗炎細胞因子[白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)和轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)]的水平。結果與陰性對照組(細胞培養液組)比較，非去白懸浮紅細胞和去白懸浮紅細胞組CD4+CD25+Treg細胞比例明顯增加，功能基因Foxp3 mRNA表達也明顯增高；IL-2和IFN-γ促炎細胞因子分泌減少，IL-10和TGF-β抗炎細胞因子分泌增多(P<0.01)。而與去白懸浮紅細胞比較，非去白懸浮紅細胞作用更加明顯(P<0.05)。結論懸浮紅細胞可能通過調節促炎/抗炎細胞因子平衡誘導異體T淋巴細胞向CD4+CD25+Treg分化，而懸浮紅細胞內殘留的白細胞可能在其中起了關鍵作用。

[關鍵詞]紅細胞輸注；T淋巴細胞；輔助誘導

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.06.016

臨床研究證實，同種異體血輸注(allogenic blood transfusion，ABT)可以誘導受血者產生免疫抑制，并由此增加術后感染率和惡性腫瘤的復發率[1-2]。目前這種輸血相關免疫抑制的確切機制仍不清楚。CD4+CD25+T細胞是最近才被人們認識的一類免疫調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)，高表達CD25、CD4和Foxp3，通過多種途徑參與機體的免疫無能和免疫抑制。異體成分血輸注引起的免疫抑制是否與CD4+CD25+Treg有關目前國內外尚未見報道。為此本研究通過體外實驗探討懸浮紅細胞對異體T淋巴細胞向CD4+CD25+Treg分化的影響及其可能機制。報告如下。

1資料與方法

1.1材料和試劑RPMI 1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司；人淋巴細胞分離液購自Axis Shield公司；CD3+T細胞磁珠分選試劑盒購自Miltenyi Biotec公司；抗CD3單克隆抗體、抗CD28單克隆抗體購自Becton Dickinson公司；異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的抗CD4單克隆抗體以及熒光素(phycoerythrin，PE)標記的抗CD25單克隆抗體均購自eBioscience公司；Western blotting試劑盒購于碧云天公司；ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2血液樣品外周全血取自健康自愿獻血者，去白懸浮紅細胞和非去白懸浮紅細胞由河北醫科大學第四醫院輸血科提供。

1.3實驗方法

1.3.1外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離取無菌肝素鈉抗凝全血，用生理鹽水將其等倍稀釋，稀釋后的血標本緩慢加入人淋巴細胞分離液液面上，比例為1∶1，4 ℃，2 000r/min離心15 min，輕輕吸取第二層環狀乳白色單個核細胞層，以PBS液洗滌2次，所得白色細胞沉淀即為PBMC，計數細胞備用。

1.3.2磁珠分離純化T淋巴細胞取1×107個PBMC，用PBS調整細胞溶液體積至50 μL；加入CD3抗體磁珠溶液10 μL，混勻，4 ℃孵育20 min；加入150 μL PBS洗滌細胞，4 ℃，3 000 r/min離心10 min；收集細胞重懸并調整細胞懸液體積至500 μL；將分選柱固定于磁柱上，用500 μL PBS預濕分選柱；將結合磁珠的細胞懸液加入分選柱內，洗滌3次，每次1 000 μL PBS；將分選柱從磁柱分開，加入1 000 μL PBS，收集流出液，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，所得沉淀物即為富集的T淋巴細胞，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸，計數備用。

1.3.3混合培養 取上述T淋巴細胞懸液加入到含有CD3抗體(2 mg/L)和CD28抗體(5 mg/L)包被的96孔板中(1×105個細胞/100 μL /孔)，然后分3組，分別于上述T細胞懸液中加入細胞培養液100 μL /孔(陰性對照組)、非去白懸浮紅細胞2×105個細胞/100 μL /孔(非去白懸浮紅細胞組)和去白懸浮紅細胞2×105個細胞/100 μL /孔(去白懸浮紅細胞組)，每組終體積200 μL，設3個復孔。于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養72 h。

1.3.4CD4+CD25+T細胞比例檢測混合培養72 h后，收集各組細胞，調整每管細胞數為2×105個，分別加入抗CD4+-FITC熒光抗體、抗CD25+-PE熒光抗體及相應同型對照，冰上孵育30 min，加入2%胎牛血清-PBS液洗滌去除未結合抗體，1 300 r/min離心6 min，洗2次，將細胞重懸至200 μL，應用EPics-XL Ⅱ型流式細胞儀檢測。

1.3.5淋巴細胞Foxp3 mRNA表達檢測混合培養72 h后，收集各組細胞，采用Trizol法提取細胞總mRNA，進行反轉錄和實時熒光定量PCR反應，引物由上海生工生物有限公司合成。使用QuantityOne軟件進行定量分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參，計算Foxp3的相對表達量。

1.3.6細胞因子檢測混合培養72 h后，收集各組細胞上清，采用ELISA法檢測細胞因子白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)、轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)的表達水平。操作按照ELISA試劑盒說明書進行。

2結果

2.1懸浮紅細胞對CD4+CD25+細胞比例和異體T淋巴細胞Foxp3 mRNA表達的影響與陰性對照組比較，非去白懸浮紅細胞和去白懸浮紅細胞組CD4+CD25+Treg 細胞比例和異體T淋巴細胞Foxp3 mRNA表達均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)；非去白懸浮紅細胞較去白懸浮紅細胞組CD4+CD25+Treg細胞比例和異體T淋巴細胞Foxp3 mRNA表達更高(P<0.05)。見表1。

2.2懸浮紅細胞對細胞因子的影響與陰性對照組相比，非去白懸浮紅細胞和去白懸浮紅細胞組上清中促炎細胞因子IL-2和IFN-γ含量明顯減少(P<0.05)，而抗炎細胞因子IL-10和TGF-β含量明顯增多(P<0.05)。非去白懸浮紅細胞與去白懸浮紅細胞組比較作用更加明顯(P<0.05)。見表2。

表1　3組CD4+CD25+Treg細胞比例及Foxp3 mRNA表達比較　Table 1　CD4+CD25+Treg cells rate and Foxp3 mRNA expression in three groups　

*P<0.01與陰性對照組比較#P<0.05與非去白懸浮紅細胞組比較(q檢驗)

表2　3組細胞因子含量比較　Table 2　Expression of IL-2,IFN-γ,IL-10 and TGF-β in three groups　

*P<0.01與陰性對照組比較#P<0.05與非去白懸浮紅細胞組比較(q檢驗)

3討論

同種異體輸血發揮臨床治療作用的同時，也會并發免疫相關的不良反應，如惡性腫瘤復發率增加、術后感染率上升、慢性病毒感染急性發作等，這些輸血引起的一系列涉及免疫調節的反應稱為輸血相關性免疫調節(transfusion-associated immunomodulation,TRIM)[3]。大量動物實驗證實血液制劑中的白細胞與由白細胞和血小板分泌并隨著儲存時間延長而蓄積的可溶性生物反應介質是引起TRIM的主要機制[4-5]。眾多臨床資料也顯示輸注去白細胞的血液制劑可降低術后感染率和腫瘤復發率[6-7]。目前血液制劑中白細胞及其他生物活性分子是通過何種途徑引起TRIM的機制仍不明確。

CD4+CD25+T細胞是是一類具有免疫調節功能的Treg，此細胞群高表達CD25+、CD4+和Foxp3，Foxp3是Treg分化和發揮功能的關鍵分子，被認為是Treg的特異性標記[8]。盡管Treg在T淋巴細胞中所占比例不大，但在調節體內免疫反應、維持機體內環境穩定和自身免疫耐受中起重要作用[9-10]。Treg具有免疫抑制性，可以非特異性的抑制CD4+和CD8+T細胞、自然殺傷細胞、B細胞以及其他免疫細胞的功能，進而降低機體對腫瘤和病原體的免疫應答。那么異體血輸注引起的TRIM是否與Treg有關呢？本研究結果顯示2組懸浮紅細胞分別與CD3/CD28抗體刺激的T細胞混合培養后，均會增加培養體系中CD4+CD25+Treg細胞的比例，同時也會增加Foxp3 mRNA的表達水平；而與去白懸浮紅細胞組相比，非去白懸浮紅細胞的作用更加明顯。提示懸浮紅細胞可促進異體T淋巴細胞向CD4+CD25+Treg細胞分化，并且促進其功能增強，而這種作用可能主要依賴于懸浮紅細胞內殘留的白細胞。

此外，T細胞分泌的細胞因子在免疫調節中也起著重要作用。IL-2和IFN-γ主要由Th1細胞分泌，是促炎因子，可以促進免疫反應的發生；IL-10和TGF-β則主要由Th2和Treg細胞分泌，是抗炎因子，主要在免疫耐受和免疫抑制中起作用[11]。兩類細胞因子互相平衡共同調節免疫反應，否則就會導致免疫功能的紊亂。研究證實Treg可抑制細胞因子IL-2的表達，從而阻斷免疫排斥反應的發生[12]；而IL-10和TGF-β可誘導CD4+CD25+Treg的生成[13]。本研究結果顯示，與陰性對照組相比，懸浮紅細胞組培養體系中IL-10和TGF-β細胞因子含量增多，IL-2和IFN-γ含量減少，從而誘導T淋巴細胞高表達Foxp3并向CD4+CD25+Treg分化；而與去白懸浮紅細胞組相比，非去白懸浮紅細胞組的這種作用更加明顯。提示懸浮紅細胞可能通過調節促炎/抗炎細胞因子平衡誘導異體T淋巴細胞向CD4+CD25+Treg分化，從而參與異體血輸注引起的TRIM，而懸浮紅細胞內殘留的白細胞在其中起了關鍵作用。但同時也提示除白細胞外，懸浮紅細胞中還存在其他成分誘導CD4+CD25+Treg的分化，只是因其作用較小，在體內可能不足以引起廣泛的免疫抑制，這種猜測還需要進一步的實驗數據和臨床證據來證實。

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(本文編輯：趙麗潔)

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《河北醫科大學學報》編輯部

[收稿日期]2015-03-15；[修回日期]2015-04-22

[基金項目]河北省醫學科學研究重點課題計劃(20100442)

[作者簡介]趙學濤(1977-)，男，河北阜城人，河北醫科大學第

[中圖分類號]R735.7

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)06-0682-04

Effect of red blood suspension on CD4+CD25+Treg differentiation
ZHAO Xue-tao1,YANG Cong-rong2,REN Xiao-liang1,

LI Ming1,XIE Xiao-yuan1,JU Hong-mei1

(1.Department of Blood Transfusion,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang

050011,China;2.Department of Radiation Oncology,the Fourth Hospital of Hebei Medical

University,Shijiazhuang 050011,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of red blood suspension on differentiation of CD4+CD25+Treg derived from allogene T lymphocytes in vitro and its underlying mechanism.MethodsCD3+T lymphocytes from human peripheral blood were isolated and purified by Ficoll density gradient centrifugation combined with adherence MACS selection.Purified human T cells were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 and then exposed to allogene leukocyte-containing red blood suspension or leukocyte-depleted red blood suspension for 72 h.The ratios of CD4+CD25+Tregs from different co-culture systems were detected by flow cytometry.The expression of Foxp3 mRNA was determined by real-time qPCR.The levels of pro-inflammatory cytokines such as interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ) and anti-inflammatory cytokines like,interleukin-10(IL-10) and transforming growth factor beta(TGF-β) in the culture supernatant were determined by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA).ResultsCompared with those of negative group (culture media),CD4+CD25+Tregs cells rate and Foxp3 mRNT expression in leukocyte-containing group and leukocyte-depleted group increased.At the same time,the cytokine of pro-inflammatory cytokines,IL-2 and IFN-γ,significantly decreased,and the anti-inflammatory cytokines,TGF-β and IL-10 increased significantly (P<0.01).The results of leukocyte-containing group were more prominent(P<0.05).ConclusionRed blood suspension could promote differentiation of T lymphocytes to CD4+CD25+Treg by regulating balance of pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokines.The regulation,to a large extent,depends on the remaining white blood cells in red blood suspension.

[Key words]erythrocytes；T-lymphocytes；cytokines

四醫院主管技師，醫學博士，從事輸血與腫瘤免疫研究。