HMGB1 RAGE蛋白在肝癌中的表達及臨床意義*

莊利萍， 于 璐， 楊 倩， 范方淑， 余 潔

(1.四川省都江堰市中醫醫院病理科， 四川 都江堰 611830 2.云南省昆明市第一人民醫院病理科， 云南 昆明 650031 3.南方醫科大學附屬南海醫院病理科， 廣東 佛山 528200)

侵襲和轉移是威脅腫瘤患者生命的主要因素，也是惡性腫瘤的基本生物學特征［1］。近年研究發現，高遷移率蛋白 B1(high－mobility group box－B1，HMGB1)是一種腫瘤轉移促進基因，其表達和腫瘤的侵襲與轉移有密切的關系［2］。晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)是細胞表面分子中免疫球蛋白超家族的成員之一，RAGE參與多種腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移［3，4］。而 RAGE 是HMGB1的唯一受體［5］。關于 HMGB1和 RAGE蛋白在原發性肝細胞癌中的表達情況，國內外鮮有報道。本研究采用免疫組織化學和計算機圖像分析技術，檢測了HMGB1、RAGE蛋白在30例原發性肝細胞癌患者癌灶組織中的表達情況，并與癌旁非癌組織進行了對比，分析了HMGB1、RAGE蛋白表達與患者臨床病理的相關性，以期為肝癌治療、預后提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選擇2008年1月至2011年3月昆明市第一人民醫院肝膽外科收治的30例原發性肝癌患者作為研究對象，30例患者中男24例，女6例，年齡36～75歲，平均(59.6±10.5)歲。瘤體＜5cm 者 16 例，≥5cm者14例。以距癌灶邊緣5cm為界分別留取癌灶組織和非癌組織。所有標本均經病理組織學證實為原發性肝細胞肝癌。

1.2 免疫組織化學法:兔抗人HMGB1多克隆抗體、鼠抗人RAGE單克隆抗體及S－P免疫組化試劑盒分別購自美國PTG公司，美國Santa Cruz公司、北京中杉金橋生物技術有限公司。肝癌及癌旁組織免疫組化以經典的S－P法進行(HMGB1工作濃度1∶100，RAGE工作濃度1∶200每片滴加HMGB1一抗，4℃冰箱過夜)DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照，用已證實的HMGB1染色陽性肝癌標本作為陽性對照。

1.3 結果判斷

1.3.1 免疫組化:每張切片在高倍鏡下(×200)隨機觀察5個視野，計數200個細胞/視野陽性細胞百分比，細胞核和/或細胞漿出現棕黃色或棕褐色染色顆粒判定為陽性細胞。陽性細胞數＜15%為表達陰性(－)，陽性細胞數15%～50%為表達弱陽性(+)，陽性細胞數51%～75%為表達中等強度陽性(++)，陽性細胞數＞75%為表達強陽性(+++)，其中陽性細胞數大于50%為過表達。同時觀察組織切片染色強度并計分:無色為陰性0分，淡黃色弱陽性1分，黃色陽性2分，棕黃色為強陽性記3分。陽性細胞百分比和組織切片染色強度兩項分值相乘為每例切片染色總積分，0分為陰性(－)，1～4分為弱陽性(+)，5～8 分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.3.2 計算機圖像分析:應用 HPIAS－1000高清晰度病理圖文分析系統定量分析免疫組化結果。每組標本均在400×放大倍數下按照無偏采樣原則取5個視野，每個視野均按照無偏采樣原則取5個細胞進行測定。依據陽性單位(PU)結果來判斷免疫組化染色強度的差異。PU值用均值±標準差(±s)表示。

1.4 統計學分析:應用SPSS11.5統計軟件進行分析。RAGE陽性表達比較用χ2檢驗。RAGE蛋白表達強度采用(±s)表示，采用單因素方差分析進行比較，組間多重比較采用LSD－t檢驗，相關分析采用Spearman等級相關，檢驗水準 ɑ=0.05。

2 結 果

表1 HMGB1、RAGE的表達與肝癌臨床病理特征的關系

表2 HMGB1、RAGE的表達與肝癌臨床病理特征的關系

圖1 HMGB1在淋巴結轉移肝癌中呈陽性表達×400

圖2 RAGE在淋巴結轉移肝癌中呈陽性表達×400

HMGB1、RAGE的表達均與患者年齡、性別、腫瘤大小無關。肝癌伴淋巴結轉移組HMGB1、RAGE的表達明顯高于肝癌無淋巴結轉移組，肝癌腫瘤組織包膜不完整者 HMGB1、RAGE的表達高于包膜完整者，HMGB1表達隨 Edmondson分級的增加而增高，而RAGE與表達Edmondson分級無相關關系。HMGB1和 RAGE 之間的表達呈正相關(rS=0.470，P=0.000)(詳見表1，2 圖1)。

3 討 論

高遷移率蛋白B1因分子量小(＜30kD)，在聚丙烯酰胺凝膠電泳快速遷移而被命名。HMGB1存在于絕大多數的真核細胞內，人HMGB1含215個氨基酸殘基，編碼基因定位于13號染色體長臂12區，其基因序列高度保守。小鼠與兔的氨基酸序列的同源性為100%，而人和嚙齒動物的氨基酸序列同源性為99%。HMGB蛋白家族特征性的序列位于151～183位氨基酸，該區域可能含有結合HMGB1受體RAGE的基序［6］。HMGB1參與穩定核小體結構、DNA重組和修復、調節基因轉錄及類固醇激素調控等生命活動［7，8］。HMBG1廣泛存在于心、腦、腎、肝、胃、脾等組織中。目前國內外研究廣泛報道，HMGB1在多種腫瘤中呈過表達［2，9］，如結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、頭頸部鱗癌、膀胱癌等，可促進一系列轉移調控基因的上調，參與腫瘤的侵襲和轉移。且其配體晚期糖基化終產物受體(RAGE)在腫瘤細胞中也有相應表達［9］，給予HMGB1或RAGE抑制劑，可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖［3］。RAGE［4，5］是侵襲相關基因家族的成員之一，RAGE是細胞表面分子中單跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族跨膜受體，RAGE在人體內分布相當廣泛，可表達于血管內皮細胞、平滑肌細胞、中性粒細胞、2型肺泡上皮細胞、肝星狀細胞、多種干細胞及腫瘤細胞等，RAGE是一個與腫瘤侵襲和轉移相關的蛋白，可在多種組織和細胞中表達，而且RAGE是HMGB1的唯一受體。HMGB1與RAGE有較高的親和力，二者結合后，通過激活細胞內JNK、NF－κB、和p42/p44、Rac1/Cdc42等信號途徑，進而激活MAPKs，PI3K/Akt，Rho GTP 酶，Jak/STAT，and Src family kinases(沉降紅細胞家族激酶)等［10］信號傳導通路，引起明膠酶A(MM P－2)和明膠酶B(MMP－9)的激活，引起纖維蛋白溶酶等系統激活，使細胞外基質降解，抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞浸潤、轉移，促進內皮細胞向腫瘤缺血區域移動和新生血管形成，加快腫瘤生長。因此，肝癌發病中HMGB1及其受體RAGE充當重要角色。

研究報道［11］，HMGB1、RAGE 協同表達參與了多種腫瘤的侵襲及轉移。Taguchi［12］等發現，HMGB1和RAGE相互作用介導C6神經膠質瘤的生長劑轉移，阻斷這一相互作用可以抑制神經膠質瘤的轉移，減少增生、浸潤，HMGB1和RAGE在結直腸癌、宮頸及食道鱗癌中的協同表達與腫瘤轉移及預后不良有關。迄今為止，關于HMGB1、RAGE與肝癌相關研究的報道少見。Sakuraoka Y［13］等檢測結果顯示肝癌細胞株HepG2中有RAGE mRNA及其蛋白的表達，說明HMGB1能刺激人肝癌細胞株HepG2的生長、增殖。Cheng等［14］研究發現，肝細胞癌患者HMGB1的血清水平比慢性肝炎及肝硬化患者明顯升高，血清HMGB1的表達與肝癌的TNM分期、病理學分級及淋巴結轉移密切相關，由此可見血清HMGB1與肝細胞癌的發生、發展有關。本課題組前期的研究表明，HMGB1在肝癌組織中呈過表達，HMGB1在包膜不完整、有淋巴結轉移肝癌中的表達分別高于包膜完整及無淋巴結轉移者。HMGB1可能是原發性肝細胞癌的一種新的潛在的腫瘤特異性標志物。與以往學者的研究結果一致。本研究結果發現，RAGE在肝癌組織有陽性表達，而在癌旁組織中弱或無表達，統計分析發現，肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。以往學者研究也發現，RAGE mRNA和蛋白在肝癌組織中表達均明顯升高，認為RAGE可能參與了肝細胞癌的發生和發展［4］。另外，本研究還發現，與無轉移和包膜完整的肝癌患者相比，有淋巴結轉移肝癌患者和腫瘤包膜不完整的肝癌患者RAGE蛋白表達均明顯增加，結果表明，RAGE的高表達還與肝癌細胞的侵襲轉移密切相關。其結果與過往學者研究發現RAGEmRNA的表達水平隨著肝細胞性肝癌臨床分期的增加而升高，患者預后越差的結果相似［6］。Spearman等級相關分析結果顯示，HMGB1和RAGE蛋白的表達呈正相關關系(rS=0.470，P=0.000)，二者在原發性肝細胞癌組織中存在協同高表達二者高表達與原發性肝細胞癌發生、發展及轉移正相關。(P＜0.05)。提示在原發性肝細胞癌分化、進展和轉移進展中，HMGB1基因和RAGE基因有相互誘導或信息傳遞的條件關系。有學者［13］采用Westem印跡和RT－qPCR方法檢測肝癌細胞株Huh7中HMGB1和RAGE的表達情況，研究結果顯示二者的表達水平與肝癌轉移密切相關，HMGB1可能通過其受體RAGE結合，從而激活NF－kB，促進肝癌細胞增殖、轉移及侵襲。

［1］ 費新雄.Survivin和MMP－2在老年宮頸癌的表達及與腫瘤侵襲轉移的關系［J］.臨床和實驗醫學雜志，2013，12(10):778～779.

［2］ Wang W，Jiang H，Zhu H，et al.Overexpression of high mobility group box 1 and 2 is associated with the progression and angiogenesis of human bladder carcinoma［J］.Oncol Lett，2013，5(3):884～888.

［3］ Pusterla T，Nèmeth J，Stein I，et a1.Receptor for advanced glycation endproducts(RAGE)is a key regulator of oval cell activation and inflammation－associated liver carcinogenesis in mice［J］.Hepatology，2013，58(1):363～373.

［4］ Gebhardl C，RiehI A，DurchdewaId M，et al.RAGE signaling sustains inflammation and promotes tumor deveIopment［J］.Exp Med，2008，205(2):275～285.

［5］ Hori O，Brett J，Slattery T，et a1.The receptor for advanced glycation end products(RAGE)is a cellular binding site for amphoterin mediation of neurite outgnmth and coexpression of rage and amphoterininthe developing nervous system［J］.Biol Chem，1995，270(43):25752～25761.

［6］ 秦慶新，肖正華，謝曉斌，等.晚期糖基化終產物受體在糖尿病足患者中的表達特征［J］.河北醫學，2012，18(6):716～718.

［7］ 牛善利，黃友敏，周永勤，等.突發性耳聾患者HMGB1和VE－cadherin含量變化的意義［J］.中華全科醫學，2011，09(3):394～395，487.

［8］ Naglova H，Bucova M.HMGB1 and its physiological and pathological roles［J］.Bratisl Lek Listy，2012，113(3):163～171.

［9］ Todorova J，Pasheva E.High mobility group B1 protein interacts with its receptor RAGE in tumor cells but not in normal tissues［J］.Oncol Lett，2012，3(1):214～218.

［10］ Kostova N，Zlateva S，Ugrinova I，Pasheva E.The expression of HMGB1 protein and its receptor RAGE in human malignant tumors［J］.Mol Cell Biochem，2010，337(1～ 2):251～258.

［11］ Kang R，Tang D，Schapiro NE，Loux T，et al.The HMGB1/RAGE inflammatory pathway promotes pancreatic tumor growth by regulating mitochondrial bioenergetics［J］.Oncogene，2014，33(5):567～577.

［12］ Taguchi A，Blood DC，Del Toro G，et a1.Blockade of RAGE－omphoterin signalling suppresses tumour growth and metastases［J］.Nature，2000，405(6784):354～360.

［13］ Sakuraoka Y，Sawada T，et al.MK615 decreases RAGE expression and inhibits TAGE－induced proliferation in hepatocellular carcinoma cells［J］.World Gastroenterol，2010，16(42):5334～5341.

［14］ Cheng BQ，Jia C Q，Liu CT，et al.Serum high mobility group box chromosomal protein 1 is associated with clinicopathologic features in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Dig Liver Dis，2008，40(6):446～452.