竹柳細胞壁綜纖維素和木質素單體及含量研究

李強　姜山

摘要：運用超聲波輔助提取、DFRC（衍生化后的還原裂解）法結合氣相色譜-質譜法（GC-MS）對竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）細胞壁綜纖維素和木質素單體進行了測定；采用差重法和Kalson法結合紫外分光光度法測定了竹柳細胞壁綜纖維素和木質素含量。結果表明，竹柳細胞壁綜纖維素單體包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質素主要由愈創木基（G）和紫丁香基（S）組成。竹柳細胞壁綜纖維素含量為80.16%，木質素含量為19.84%。

關鍵詞：竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）；綜纖維素；木質素；衍生化后的還原裂解（DFRC）法

中圖分類號：S781.42 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0097-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.025

植物細胞壁主要由綜纖維素、木質素和蛋白質組成，作為植物光合作用產物的主要貯積方式，構成了地球植物生物量的主要組成部分。纖維素是無水葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的長鏈分子，半纖維素是戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖[1]，木質素是由苯丙氨酸經脫氨莖、羥基化、甲基化和氧化還原反應，生成3種主要單體香豆醇、松柏醇和芥子醇，這些單體經氧化偶聯聚合生成相應的3種木質素：對羥基苯基木質素（H）、愈創木基木質素（G）和紫丁香基木質素（S）[2]。綜纖維素和木質素是組成木材的主要成分，它們的組成及含量與木材的性質以及木材的加工利用密切相關[3]。一般情況下，纖維素含量越高，則制漿率越高；而木質素交聯在纖維素和半纖維之間形成致密的網狀結構，是木材造紙的一大難題，木質素含量越低，制漿漂白越容易，消耗的化學藥品越少[4，5]。通過基因工程方法調控木質素含量和組成類型，優化植物光合作用所生產的生物量在綜纖維素和木質素之間的分配對木材的制漿性能有很大的潛在價值[6]。測定細胞壁中綜纖維素和木質素單體成分及含量無疑為提升木材工業化應用提供了重要參考依據。

竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）為楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）落葉喬木，是經選優選育出的一個柳樹品種，由于其同時具有染色體加倍實現的倍性優勢和雜種優勢，故不僅具備柳樹所有優良特性，且具有生長速度快、抗逆性強、材質好等特點，因此作為工業原料林具有一定優勢[7]。以往對于竹柳的研究主要集中在纖維質量及制漿性能方面，對于其細胞壁中綜纖維素和木質素的單體成分及含量報道非常少。為此，采用超聲波輔助提取、衍生化后的還原裂解（DFRC）法結合GC-MS分析了竹柳細胞壁綜纖維素和木質素單體成分，同時還采用差重法和Kalson法結合紫外分光光度法測定了綜纖維素和木質素含量對DFRC法結果加以驗證，以期為更好地開發利用竹柳奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為取自貴州省黔南地區的一年生竹柳。

儀器：QP2010c型氣相-質譜聯用儀（Shimadzu公司，數據庫為NIST27、NIST147）；LX-02多功能粉碎機；101A-3型電熱鼓風干燥箱；HHS型電熱恒溫水浴鍋；分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-1001型EYELA旋轉蒸發儀；精密酸度計（上海大普儀器有限公司）。

試劑：乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸、溴乙酰、二氧六環、鋅粉、膽固醇，均為市售分析純。

1.2 細胞壁樣品提取

樣品粉碎后，過60～80目篩，然后每克樣品加40 mL體積分數80%的乙醇超聲處理10 min，4 000 r/min離心5 min，去上清，重復4次，再依次用氯仿/甲醇（2∶1，V∶V）和丙酮抽提1次，空氣風干[8]。

1.3 DFRC法分析細胞壁樣品

1.3.1 溴乙酰衍生和細胞壁溶解反應 準確稱量50 mg（W1）細胞壁樣品加到50 mL具塞三角瓶中，加入10 mL新鮮配制的溴乙酰溶液（溴乙酰∶乙醇=1∶4，V/V），蓋上玻璃塞于50 ℃輕輕攪拌3 h，然后在50 ℃以下負壓蒸干[9]。

1.3.2 還原斷裂反應 向具塞三角瓶中加入10 mL二氧六環/乙酸/水（5∶4∶1，V/V/V），再加入200 mg（W2）鋅粉，常溫攪拌30 min，然后用砂芯漏斗過濾，濾渣于60 ℃烘至恒重（W3），濾液全部轉入預先備有15 mL二氯甲烷和15 mL飽和氯化銨的分液漏斗中，加入200 μL內標（80 mg膽固醇溶解于2 mL二氯甲烷），水相用3%的鹽酸調到pH 3以下，充分混勻，靜置分層并收集下部二氯甲烷相。另外用15 mL二氯甲烷萃取飽和氯化銨相，重復2次，合并二氯甲烷相，低壓旋轉蒸干，乙酰化后上GC-MS分析[10]。

1.3.3 計算反應率 反應率=■ （1）

1.4 竹柳細胞壁綜纖維素含量測定

稱取約1.5 g細胞壁樣品，于60 ℃烘至恒重W4，再轉入250 mL碘量瓶中，加入150 mL 2 mol/L的HCl，105 ℃保溫50 min，然后用去離子水沖洗過濾至濾液pH 6.5～7.0，接下來依次用體積分數95%的乙醇、無水乙醇、丙酮各洗滌2次，殘渣轉入已恒重的坩堝（W5）中，于60 ℃干燥箱中烘至恒重（W6）。將殘渣轉入150 mL燒杯中，加入15 mL預冷過的72%的硫酸水解3 h，然后加去離子水135 mL，室溫過夜，殘渣次日用去離子水沖洗過濾至濾液pH 6.5～7.0，濾渣轉入已恒重的坩堝（W7）中，于60 ℃干燥箱中烘至恒重（W8）。按公式（2）、（3）、（4）計算半纖維素、纖維素和綜纖維素含量，平行測定樣品6份，取平均值[11，12]。endprint

半纖維素含量=■×100% （2）

纖維素含量=■×100% （3）

綜纖維素含量=半纖維素含量+纖維素含量（4）

1.5 竹柳細胞壁木質素含量測定

準確稱量1 g（W9）細胞壁樣品，加72%的硫酸15 mL，室溫攪拌4 h，轉入1 000 mL圓底燒瓶中，加560 mL去離子水稀釋硫酸濃度至3%，加熱回流2 h，再用砂芯漏斗過濾，收集濾液，殘渣用熱水洗滌至中性，轉入已恒重的坩堝（W10）于105 ℃烘干至恒重，稱量（W11）并按公式（5）計算酸不溶木質素含量，平行測定樣品6份，取平均值[12，13]。

酸不溶木質素含量=■×100% （5）

濾液在205 nm波長下測吸光度，如果吸光度大于0.7，則用3%的硫酸溶液稀釋，當吸光度為0.2～0.7，按公式（6）和公式（7）計算，平行測定樣品6份，取平均值。

B=■×D （6）

酸溶木質素含量=■×100% （7）

式中，B為濾液中酸溶木質素的含量（g/1 000 mL）；A為吸光度；D為樣品濾液的稀釋倍數；V為濾液總體積；110為吸光系數[L/（g·cm）]。

木質素含量=酸不溶木質素含量+酸溶木質素含量 （8）

2 結果與分析

2.1 DFRC法分析細胞壁成分

衍生化后的還原裂解（DFRC）法包括兩個重要步驟：①細胞壁在溴乙酰和乙酸混合溶液中溶解，②鋅粉催化還原裂解，在溴乙酰中植物細胞壁被溶解，酸性環境下細胞壁多糖進一步水解[14，15]，結合GC-MS通過查找數據庫可以確定樣品DFRC法獲得的化合物組成，進一步解析樣品細胞壁成分。通過計算反應率得出，大于95%的竹柳細胞壁參加了反應，所以試驗中DFRC法產物包含了竹柳細胞壁的主要物質組成。

表1是竹柳細胞壁DFRC降解物氣相色譜檢測到的主要化合物保留時間、名稱以及含量，除9和10是內標膽固醇及其乙酰化產物外，1～8是竹柳細胞壁DFRC法檢測到的主要產物：D-木糖乙酸酯、L-阿拉伯糖乙酸酯、D-半乳糖乙酸酯、愈創木基乙酸酯、D-葡萄糖乙酸酯、紫丁香基乙酸酯、L-巖藻糖乙酸酯和D-纖維二糖乙酸酯。根據構成綜纖維素和木質素的單體類型可知，竹柳細胞壁綜纖維素單體主要是D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質素的單體主要是G型和S型，沒有檢測到H型單體。不計算內標的情況下，綜纖維素和木質素的含量分別為80.16%和19.84%。

2.2 竹柳細胞壁綜纖維素和木質素含量分析

半纖維素是戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖，易水解，高溫下經稀酸處理幾乎可以把半纖維素全部水解成可溶性糖；纖維素是β-1，4糖苷鍵組成的長鏈分子，長鏈分子進一步形成一種具有高度結晶區的超分子穩定結構，該結構可以被濃酸溶解，在溶解過程中導致纖維素的均相水解[1]，因此依次用鹽酸、硫酸水解竹柳，準確稱量水解前后的重量并計算差重可以得出半纖維素、纖維素以及綜纖維素含量。采用Klason法和紫外分光法分別測定酸不溶木質素和酸溶木質素含量，試驗沒有檢測植物含有的少量礦質元素，結果見表2。從表2可知，綜纖維素含量為79.03%，木質素含量為20.35%，對比DFRC法測定的糖類和木質素類含量，可以得出兩種方法測得的結果基本一致，說明DFRC法檢測出的竹柳細胞壁各成分含量可靠。

3 小結

竹柳細胞壁綜纖維素單體主要包括D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質素單體主要為G型和S型。據文獻報道，硬木H型木質素單體含量一般很少甚至沒有，Lu等[9，14]在同是柳屬的柳樹中檢測到的H型木質素單體含量相對于G型和S型也非常低（<1%），而試驗在竹柳細胞壁中沒有檢測到明顯的H型木質素單體，原因有可能是竹柳細胞壁中H型木質素單體的含量過低，或是沒有H型木質素單體的存在，這需要進一步的試驗論證。同時還測得綜纖維素含量為80.16%，木質素含量為19.84%。試驗中采用的DFRC法是美國威斯康星州牧草研究中心建立的用于解析細胞壁結構的新方法，具有對試驗條件要求不高、操作流程簡潔和結果可靠等優點，目前國內鮮有將該方法運用于硬木細胞壁的研究。利用該方法對竹柳細胞壁綜纖維素和木質素單體及含量的研究，將為竹柳在工業木材應用中的深入發展奠定一定的基礎，還可為其他工業木材的定性定量分析提供借鑒。

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