野柿子樹葉單寧的半仿生法提取及抗氧化性分析

余先純　吳瑛　韓大良

摘要：采用半仿生法提取野柿子樹葉單寧，對其提取工藝進行優化，并對其抗氧化能力進行檢測。結果表明，采用半仿生法能夠提高單寧對OH·、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力，其IC50值均低于水浴加熱法及酶法提取。正交試驗優化得到的最佳工藝條件為提取溫度40 ℃、提取時間60 min、溶劑體積分數50%、3次提取液pH分別為2.0、7.8和9.0以及原料粒度120目。在此條件下，單寧提取量可達206.8 mg/g，遠高于水浴加熱法及酶法提取的樣品。

關鍵詞：野柿子樹葉；單寧；半仿生法；抗氧化能力

中圖分類號：S792.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0148-04

單寧是一種存在于植物中具有多酚羥基結構的水溶性物質，能與金屬離子螯合，并能與蛋白質、生物堿、多糖等發生反應。具有優異的生物活性、較強的抗氧化性[1，2]、優良的抗病毒活性以及抑制致癌物及腫瘤活性等功能[3，4]，在預防和治療自由基所引起的疾病、抗艾滋病、抑制脂質及其他物質的過氧化作用等方面顯示出獨特的優越性，廣泛用于醫藥[5]、食品、皮革及印染工業。

目前，國內外單寧的生產主要是采用水浴加熱法和酶法從黑荊樹皮和松樹皮中提取，這不僅會損傷活立木，而且提取的時間長、單寧的生物活性也難以保證。半仿生法（SBE）作為一種新型的提取工藝，在生物制藥中具有較好的前景，它采用活性指導下的導向分離方法，從而保證被提取物的生物活性[6]。而野柿子的青果和樹葉中均含有豐富的柿子單寧，且野柿子樹在湘西地區分布廣泛。本研究以野柿子樹葉為原料，采用半仿生法提取野柿子樹葉單寧，對其提取工藝進行優化，檢測其抗氧化能力。這種方法不僅不會損傷林木，且在一定程度上能夠保證單寧的生物活性，同時也能為從樹葉中提取單寧，并保證其活性提供一種切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 原料與設備

野柿子樹葉（采自湘西地區），乙醇、乙酸鋅、EDTA、鉻黑T等試劑均為分析純。

主要設備有SHZ-82型數顯水浴恒溫振蕩器、FW117型中草藥粉碎機。

1.2 方法

1）將殺青后的野柿子樹葉干燥、粉碎至30目，用溶劑與水按一定的比例混合后作為提取溶劑，模擬胃腸道的pH（表1），在一定的溫度下回流提取3次。

2）將3次提取所得提取液合并，4 500 r/min離心30 min，除去殘渣，將得到的分離液經過真空濃縮后在50～60 ℃溫度下干燥，即得到野柿子樹葉單寧。

3）按照上述步驟，在其他條件相同的情況下，用酶法和水浴加熱法進行對比試驗。

4）在探索性試驗的基礎上以提取液pH、溶劑體積分數、提取時間、提取溫度、原料粒度等為因素進行單因素試驗。

5）正交試驗：用乙醇為溶劑，采用L16（45）正交試驗對提取液pH（A）、溶劑體積分數（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）、原料粒度（E）5個有重要影響的因素進行設計，正交試驗因素和水平如表2所示。

1.3 單寧含量測定

采用乙酸鋅絡合滴定法測定單寧的含量[7]。

1.4 清除自由基能力測定

清除OH·能力的檢測參照Smimoff的方法[7]；清除DPPH·能力的檢測參照文獻[8，9]的方法；清除ABTS+·能力的檢測參照文獻[10，11]的方法。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取液pH的影響 選取提取液為體積分數60%的乙醇、提取時間65 min、提取溫度50 ℃及原料粒度80目進行試驗，其pH按照表1中的設置進行調節，進行9組試驗，結果如圖1所示。由圖1可知，7號試樣的單寧提取量最高，達到199.3 mg/g，即酸性環境pH 2.0、弱堿性環境pH 7.5、堿性環境pH 9.5，因此，后續試驗中提取液的pH分別采用2.0、7.5和9.5。

2.1.2 溶劑體積分數的影響 分別用體積分數為40%、50%、60%、70%和80%的甲醇、乙醇、丙酮溶液作為提取液，在酸性環境、弱堿性環境和堿性環境中的pH分別為2.0、7.5、9.5，每次提取時間65 min、溫度45 °C、原料粒度80目。試驗結果如圖2所示，體積分數為60%的乙醇溶液的單寧提取量最高，同時還可以看出，當乙醇用量超過60%后單寧提取量有下降的趨勢。這可能與單寧的組成和性質相關，乙醇體積分數在60%時，單寧的溶解度達到最大，而乙醇體積分數在遠離60%時，混合溶液對單寧的溶解具有選擇性，即在小于60%時，提取的可能是水溶性單寧，而在大于60%時，提取的可能是醇溶性單寧[12]。因此，可選取60%的乙醇溶液作為提取液。

2.1.3 提取時間的影響 選取60%乙醇為溶劑，3次提取液的pH分別為2.0、7.5、9.5，提取溫度45 ℃，不同提取時間和原料粒度對單寧提取量的影響如圖3所示，在相同時間內原料粒度越細，單寧的提取量越高，但粒度為160目的提取量與120目的相比差異不明顯。在原料粒度為120目及160目時，提取量隨著時間的延長而快速增大，65 min后，提取量增幅減緩。這是因為在提取初期，野柿子樹葉中單寧的含量較大，因此提取量快速增加；隨著時間的延長，單寧的含量逐步減少，故提取量增加較少。因此，選擇提取時間為65 min。

2.1.4 提取溫度的影響 選取60%乙醇為溶劑，3次提取液的pH分別為2.0、7.5、9.5，提取時間為65 min，不同提取溫度和原料粒度對提取量的影響如圖4所示，原料粒度為120目及160目時，在溫度45 °C時單寧提取量達到最大，然后開始下降。這可能是由于單寧的結構穩定性較差，高溫加熱發生氧化或水解反應使提取量降低。因此，提取溫度選擇45 ℃。endprint

2.1.5 原料粒度的影響 原料粒度對單寧提取率的影響見圖3及圖4，用乙醇提取野柿子樹葉中的單寧，粒度40目時，單寧的提取量最低，160目時提取量最高，雖然原料粒度160目高于原料粒度120目的提取量，但二者差異不明顯。從生產成本角度考慮，野柿子樹葉單寧的原料粒度以120目為最佳。

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果與極差分析如表3所示。由表3可知，影響野柿子樹葉單寧提取量的因素大小順序為D、C、B、A、E，工藝的最佳組合為A4B3C3D4E2，即：提取溫度40 ℃、提取時間60 min、溶劑體積分數50%、3次提取液pH 2.2、7.8和9.0、原料粒度120目。按上述最優條件進行3次驗證試驗，單寧平均提取量為206.8 mg/g。而水浴加熱法所得單寧的提取量為196.2 mg/g、酶法所得單寧的提取量為162.5 mg/g。

2.3 清除自由基能力

表4中為水浴加熱法、酶法及半仿生法所提取的單寧對自由基清除的情況。采用半仿生法提取的單寧對OH·、DPPH·和ABTS+·的清除率均高于水浴加熱法及酶法。這可能是因為野柿子樹葉單寧在水浴加熱法及酶法提取中發生氧化、異構等變化。而半仿生法工藝可以降低提取溫度、縮短提取時間、防止高溫下單寧的氧化，因此不會對其分子結構與理化性質產生過大的影響，并保持了單寧的生理活性。

3 小結

采用半仿生法提取野柿子樹葉單寧最佳工藝條件為提取溫度40 ℃、提取時間60 min、溶劑體積分數50%、3次提取液pH分別為2.2、7.8和9.0、原料粒度120目。在此工藝條件下單寧提取量可達206.8 mg/g，高于水浴加熱法及酶法所提取的單寧提取量，且得到的單寧對OH·、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力均高于水浴加熱法及酶法提取的樣品。

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