多黏芽孢桿菌HD—1產β—甘露聚糖酶的條件優化

程愛芳　鄧政東　黃芳一　陳文　周念波

摘要：采用DNS比色法，通過單因素試驗和正交試驗對多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）HD-1產β-甘露聚糖酶的培養基主要成分和培養條件進行優化。結果表明，該菌種產β-甘露聚糖酶的最適培養基為魔芋粉0.75%、酵母膏1.00%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.05%，培養基初始pH 9.0；最適培養條件為接種量6%，培養溫度31 ℃，培養時間27 h。在此優化條件下，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶活性可達72.6 U/mL。

關鍵詞：多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）；β-甘露聚糖酶；發酵條件；優化

中圖分類號：Q939.97 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0164-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.042

β-甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，降解產物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等[1-3]。β-甘露聚糖酶可以用于飼料工業，能消除甘露聚糖對單胃動物各種營養素的抗營養作用[4-6]，還可用于糖鏈結構的分析、造紙業、紡織業、石油業等。微生物是產生β-甘露聚糖酶的主要來源，且具有活力高、成本低、來源穩定、提取方便等明顯優點[7，8]。本試驗以多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）為生產菌株，通過單因素試驗和正交試驗[9，10]對多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的培養基成分和培養條件進行優化，以提高其產酶活力，為后續的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 多黏芽孢桿菌突變菌株HD-1，由武漢生物工程學院發酵工程實驗室保藏。

1.1.2 培養基 斜面活化培養基：3 g/L牛肉膏、10 g/L蛋白胨、5 g/L氯化鈉、20 g/L瓊脂，pH 7.4；液體種子培養基：5 g/L魔芋粉、10 g/L酵母膏、1g/L硫酸鎂、0.5 g/L磷酸二氫鉀、1 g/L硫酸銨，pH 7.5；基礎產酶培養基：5 g/L魔芋粉、10 g/L蛋白胨、0.2 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L硫酸鎂，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 將保存的多黏芽孢桿菌HD-1接種于斜面活化培養基上，35 ℃活化培養24 h。取一環活化后的菌種HD-1，接入裝有50 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中，200 r/min、35 ℃恒溫培養24 h。以4 %接種量將液體種子接入盛有50 mL基礎產酶培養基的250 mL三角瓶中，200 r/min、35 ℃恒溫搖床振蕩培養24 h。將培養了24 h的發酵液5 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液即為粗酶液，4 ℃保存備用。

1.2.2 甘露聚糖酶活性的測定 以酶活為指標，以魔芋膠為底物，采用DNS比色法測定發酵液中甘露聚糖酶的活性[7]。在上述條件下，每分鐘由底物釋放出相當于1 μmol D-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.3 菌種產酶條件的單因素試驗 以基礎產酶培養基為基礎，研究不同碳源、氮源、培養溫度、培養基初始pH、搖床轉速、接種量、裝液量、發酵時間對多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的影響。

1.2.4 正交試驗優化產酶培養基 根據單因素試驗結果，取對培養基影響較大的4個因素魔芋粉、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，每因素取3個水平，采用L9（34）正交試驗優化產酶培養基。試驗因素及水平見表1。

1.2.5 正交試驗優化培養條件 根據單因素試驗結果，取對培養條件影響較大的4個因素培養溫度、培養基初始pH、接種量、發酵時間，每因素取3個水平，采用L9（34）正交試驗優化產酶培養條件。試驗因素及水平見表2。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源對發酵產酶的影響 選取6種碳源進行多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的培養，結果如圖1所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適碳源為魔芋粉。在確定魔芋粉為最適碳源后，對其用量進行試驗，結果如圖2所示，魔芋粉的用量在0.25%至1.00%時，β-甘露聚糖酶活力較高，0.75%時達到最高，超過1.00%后，酶活力迅速下降，因為魔芋膠為粘多糖，濃度太高影響培養基的流動性和溶氧量，不利于產酶。

2.1.2 不同氮源對發酵產酶的影響 選取6種氮源進行多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的培養，結果如圖3所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適氮源為酵母膏。在確定酵母膏為最適氮源后，對其用量進行試驗，結果如圖4所示，酵母膏用量在0.25%至1.00%時，β-甘露聚糖酶活力不斷升高，1.00%時達到最高，超過1.00%后，酶活迅速下降。

2.1.3 培養基初始pH對發酵產酶的影響 不同菌株發酵的最適培養基初始pH相差較大，本試驗設定8個pH梯度進行多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的培養，結果如圖5所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適初始pH為9.0。

2.1.4 裝液量對發酵產酶的影響 裝液量的多少影響發酵過程中的通氣及溶氧情況從而影響產酶。不同裝液量對多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的影響結果如圖6所示。由圖6可知，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的搖瓶發酵最適裝液量為50 mL/250 mL。

2.1.5 接種量對發酵產酶的影響 接種量對發酵產酶的影響結果如圖7所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適接種量為6%，因為過大的接種量引起短時間內菌體大量生長繁殖，從而使溶氧不足，不利于產酶。

2.1.6 培養溫度對發酵產酶的影響 溫度對多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的影響結果如圖8所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適培養溫度為33 ℃，超過33 ℃菌體提前衰老，酶活迅速下降。endprint

2.1.7 搖床轉速對發酵產酶的影響 搖床轉速對多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的影響結果如圖9所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適搖床轉速為240 r/min。轉速太小，影響通氣量，不利于產酶；轉速太大，氣體停留時間縮短從而使得溶氧量減低，同時剪切力過大，不利于產酶。

2.1.8 發酵時間對發酵產酶的影響 發酵時間對多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的影響結果如圖10所示，多黏芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的最適發酵時間為30～48 h。發酵時間過短，微生物沒有充分生長，時間過長，微生物發生自溶，均不利于產酶。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 培養基成分正交試驗結果 由表3可知，影響多黏芽孢桿菌HD-1產β-甘露聚糖酶的培養基成分因素由大到小順序為A、B、C、D，優化組合為A2B2C3D1，即魔芋粉0.75%、酵母膏1.00%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.05%。

2.2.2 培養條件正交試驗結果 由表4可知，影響多黏芽孢桿菌HD-1產β-甘露聚糖酶的培養條件因素由大到小順序為H、E、G、F，最優組合為E1F3G2H2，即培養溫度31 ℃、初始pH 9.0、接種量6%、發酵時間27 h。

3 小結

通過單因素和正交試驗對多黏芽孢桿菌HD-1的培養基成分和培養條件進行了優化，得到其產β-甘露聚糖酶的最優發酵條件為魔芋粉0.75%、酵母膏1.00%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸鎂0.05%、培養基初始pH 9.0，培養溫度31 ℃、接種量6%、發酵時間27 h。在此條件下，β-甘露聚糖酶活力可達72.6 U/mL。另外，從2個正交試驗結果可以看出，魔芋粉用量、酵母膏用量、培養溫度和發酵時間對產酶影響較大，嚴格控制有利于產酶。

參考文獻：

[1] 殷瑩瑩，謝達平，戴曉陽.β-甘露聚糖酶高產基因工程菌株發酵條件優化[J].湖南農業科學，2009（4）：5-10.

[2] 段 蕾，高潤池，許 波.β-甘露聚糖酶產生菌的分離、鑒定及酶學特性研究[J].安徽農業科學，2008，36（24）：10311-10314.

[3] 崔福綿，石家驥，魯茁壯.枯草芽孢桿菌中性β-甘露聚糖酶的產生及性質[J].微生物學報，1999，39（1）：60-63.

[4] 喬欣君，鄒曉庭.β-甘露聚糖酶的營養功能及在動植物生產中的應用[J].飼料研究，2006（2）：53-55.

[5] 徐紅蕊.β-甘露聚糖酶之國內外最新研究概況[J].湖南飼料，2008（2）：30-32.

[6] 趙德立.多粘芽孢桿菌JW2725抗菌活性物質及其發酵條件的初步研究[J].植物保護，2006，32（1）：47-50.

[7] 李桂伶.芽孢桿菌所產β-甘露聚糖酶性質研究[J].飼料廣角，2009（1）：28-30.

[8] 張道敬.多粘類芽孢桿菌HY9622的化學成分[J].華東理工大學學報（自然科學版），2008，34（1）：71-73.

[9] 王旭愿，張 敏，李成濤，等.洋蔥假單胞菌產脂肪酶條件的優化[J].湖北農業科學，2014，53（1）：184-187.

[10] 馬 勇，陳秀莉，劉曉光.一株產油酵母菌搖瓶產油發酵條件的優化[J].湖北農業科學，2014，53（1）：25-27.endprint