左旋精氨酸通過激活L-arg-NO通路對異丙腎上腺素致大鼠心力衰竭的作用

李偉建，方 達，梁利軍，吳玉蕾，潘睿晗，于 越，劉曉凡，桑黎黎

左旋精氨酸通過激活L-arg-NO通路對異丙腎上腺素致大鼠心力衰竭的作用

李偉建1，方 達1，梁利軍1，吳玉蕾1，潘睿晗1，于 越1，劉曉凡2，桑黎黎2

目的探究左旋精氨酸（L-arg）通過激活L-arg-NO通路對異丙腎上腺素（ISO）導致的大鼠心力衰竭的保護作用。方法雄性SD大鼠隨機分為對照組、ISO組、L-arg干預組。腹腔注射ISO復制大鼠心力衰竭模型，灌胃給予L-arg。30 d后監測血流動力學參數：心率（HR）、左室收縮壓力（LVSP）、左室舒張末期壓力（LVEDP）、左室壓力最大上升或下降速率（±dp／dtmax），計算心肺系數，檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）含量以及一氧化氮合酶（NOS）活性；HE染色觀察心肌組細胞排列；Masson染色觀察心肌膠原纖維并計算心肌膠原纖維容積分數（CVF）。結果與對照組比較，ISO組大鼠血流動力學參數：HR、LVSP、+dp／dtmax降低，LVEDP、-dp／dtmax升高，心肺系數增加，血清TNF-α、SOD升高，NO、NOS降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。L-arg干預組HR、LVSP、+dp／dtmax均高于ISO組，LVEDP、-dp／dtmax、心肺系數低于ISO組，血清SOD和TNF-α降低，NO和NOS增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。HE染色顯示對照組心肌細胞形態正常，間質無擴張充血，心肌細胞排列整齊；ISO組心肌細胞排列紊亂，炎性細胞浸潤，而L-arg干預組心肌細胞接近對照組。ISO組Masson染色心肌細胞間可見大量藍染的膠原纖維，而對照組觀察不到藍染區域，L-arg干預組在對照組與ISO組之間；ISO組CVF明顯高于L-arg干預組（P＜0.05），L-arg干預組高于對照組（P＜0.05）。結論L-arg可以通過激活L-arg-NO通路，增加機體內NO含量，改善血流，減輕心肌重構，產生對心力衰竭心肌的保護作用。

左旋精氨酸；L-arg-NO通路；異丙腎上腺素；心力衰竭

心力衰竭是一種臨床上常見的嚴重的心血管疾病，其主要是由心肌細胞、心內膜或大血管、心包膜異常引起；然而絕大多數情況下，心力衰竭的發生都與心肌細胞功能的損害有關［1］。一氧化氮（nitric oxide，NO）是人體多種細胞均可以產生的自由基，在全身各處分布廣泛。左旋精氨酸（L-arginine，L-arg）作為NO的前體可通過抗氧自由基、改善心肌能量代謝、增加冠狀動脈血流量和抑制中性粒細胞聚集等具有對心血管系統的保護作用［2］。提供外源性的L-arg可以拮抗脂質過氧化，減輕心臟缺血-再灌注損傷［3-4］；改變心臟移植物血管病變，抑制平滑肌細胞增殖，保持內皮功能穩定［5］；降低血脂膽固醇，阻止動脈粥樣硬化斑塊進展，減少高膽固醇血癥和冠心病心絞痛的發生［6］；對血壓調節，高血壓治療等方面的效果都較為肯定，在臨床上應用廣泛［7-8］。然而目前國內外對于L-arg治療心力衰竭的研究報道甚少，該實驗研究L-arg干預對心力衰竭心肌細胞功能的影響以及一氧化氮合酶（nitric oxide syntheses，NOS）活性的變化，探討L-arg對心力衰竭心肌的作用，從而為L-arg的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，重（220± 20）g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。每6只分籠飼養，標準嚙齒類動物飼料喂養，自由進食飲水。

1.1.2 實驗藥品及試劑 L-arg購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、NO、NOS試劑盒均購自南京建成生物有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）測定試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 實驗儀器 Power Lab數據采集分析系統（澳大利亞AD Instruments公司）；電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；128ce酶標儀（澳大利亞Clinibio公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Heraeus公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與心衰模型制作 24只雄性SD大鼠隨機分為對照組、ISO組、L-arg干預組，每組8只。①對照組：大鼠腹腔注射生理鹽水3 ml／kg，早晚各1次；第2次腹腔注射生理鹽水后灌胃1 ml／（kg·d）蒸餾水；②ISO組：大鼠腹腔注射ISO 3 mg／kg，2次／d［9］，早晚各1次，第2次腹腔注射ISO后灌胃1 ml／（kg·d）蒸餾水；③L-arg干預組：大鼠腹腔注射ISO 3 mg／kg，2次／d，早晚各1次，第2次腹腔注射ISO后灌胃L-arg 250 mg／（kg·d）［10］。以上操作每天1次，各組腹腔注射10 d，灌胃30 d后實驗。

1.2.2 左室血流動力學監測 灌胃30 d后的次日，將各組大鼠稱重、麻醉、固定、頸部剪毛備皮。取頸正中縱行切開，經頸總動脈將連有壓力換能器的充滿肝素的導管插入左心室。壓力信號由壓力換能器轉變為電信號輸入Power Lab生物信號采集系統，Chart 7.0軟件記錄心率（heart rate，HR）、左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室內壓上升或下降的最大變化速率（maximal or minimal differentials of left ventricular developed pressure，±dp／dtmax）。各組大鼠監測30 min，監測完成后頸總動脈取血2 ml，4℃條件下3 000 r／min，離心15 min，取上層血清-20℃保存備用。

1.2.3 心肺系數測定 取血完成后立即開胸，切除大鼠心臟和肺并在冰生理鹽水中漂洗直至生理鹽水變得澄清，濾紙拭干，用電子天平稱重大鼠心臟和肺并記錄數值，計算各組大鼠心肺系數［心重（mg）／體重（g），肺重（mg）／體重（g）］。

1.2.4 血清TNF-α、SOD、NO和NOS的測定 取已保存的上層血清，按試劑盒說明書分別測定TNF-α、SOD、NO和NOS含量。TNF-α測定采用ELISA法，SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，NO測定采用硝酸還原法，NOS活性測定采用比色法。

1.2.5 HE染色方法 切取左心室大部分組織，置于10%的甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。染色時，提前將片子置于60℃培養箱加熱過夜，后行脫蠟HE染色并進行顯微鏡下觀察。

1.2.6 Masson染色和膠原纖維容積分數（collagen volume fraction，CVF）測定 在100倍顯微鏡下觀察心肌組織切片Masson染色后，膠原纖維與細胞核呈現藍色，心肌細胞胞質呈現紅色。將Masson染色在400倍鏡下隨機選擇4個視野，血管膠原聚集的區域邊界不包括在內，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統進行統計，軟件可以直接計算出CVF。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 5.01統計軟件分析，計量資料均采用表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 大鼠體重和血流動力學參數變化與對照組比較，ISO組HR、LVSP、+dp／dtmax降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；LVEDP、-dp／dtmax升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與ISO組比較，L-arg干預組HR、LVSP、+dp／dtmax升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；而LVEDP、-dp／dtmax明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 心肺系數與對照組比較，ISO組大鼠心臟和肺系數顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與ISO組比較，L-arg干預組心臟和肺系數低于ISO組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 L-arg干預對血清SOD、TNF-α、NO和NOS水平的影響與對照組比較，ISO組SOD含量和TNF-α水平明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與ISO組比較，L-arg干預組SOD含量和TNF-α水平增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、3。與對照組比較，ISO組NO含量和NOS活性明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ISO組比較，L-arg干預組NO含量和NOS活性均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

表1 各組大鼠血流動力學參數的比較（）

表1 各組大鼠血流動力學參數的比較（）

與對照組比較：**P＜0.01；與ISO組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項目對照組（n＝8）ISO組（n＝8）L-arg干預組（n＝8）F值P值第1天體重（g）208±12210±10206±14--第30天體重（g）280±16253±18272±15--HR（次／min）390±8.97321±11.30**382±9.56＃＃14.320.000 1 LVSP（kPa）13.63±0.619.87±0.77**12.84±0.44＃10.650.000 6 LVEDP（kPa）0.43±0.101.26±0.14**0.71±0.15＃10.620.000 6 +dp／dtmax（kPa／s）337.33±13.07300.93±12.40318.67±14.13＃13.270.000 1 -dp／dtmax（kPa／s）328.40±12.00285.73±11.33**313.73±12.67＃＃23.110.000 1

2.4 心臟HE染色觀察對照組大鼠心肌細胞形態學正常，胞質染色均勻，間質無擴張充血，心肌纖維整齊排列，心肌橫紋排列清晰，無顯著異常。ISO組大鼠心肌細胞具有不同程度的病理變化，主要表現為細胞肥大、壞死、凋亡，炎性細胞浸潤，心肌細胞斷裂、扭曲，心肌橫紋模糊。L-arg干預組心肌細胞排列整齊無病理變化，與對照組基本相似。見圖5。

2.5 Masson染色和心肌CVFISO組Masson染色心肌細胞間可見大量藍染的膠原纖維，而對照組觀察不到藍染區域，L-arg干預組在對照組與ISO組之間。與對照組比較，ISO組CVF明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，L-arg干預組心肌CVF明顯降低（P＜0.05），3組間比較差異有統計學意義（F＝4.05，P＜0.05）。見圖6、7。

3 討論

心力衰竭是許多心血管疾病，如冠心病、高血壓、心臟病、嚴重心律失常等的終末階段和最主要的死因，是一種嚴重的臨床癥狀綜合征［11］，其中心肌損傷和重構是導致心力衰竭的最主要原因。因此，探討心肌損害的發病機制，尋找有效的防治措施，具有重要的臨床意義。本實驗通過腹腔注射ISO制作心力衰竭模型，心肺系數明顯增加，有創血流動力學異常，HE染色切片觀察心肌細胞排列紊亂，炎性細胞浸潤，Masson染色觀察間質膠原纖維增加，說明心衰時心肌細胞發生了重構，這些均表明心力衰竭模型復制成功。TNF-α來自于巨噬細胞，當發生心力衰竭心肌損傷時巨噬細胞釋放TNF-α參與炎癥反應，因此，測定血清TNF-α含量可以反映心肌損傷程度［12］。SOD的心肌毒性，主要是和氧自由基損傷、細胞凋亡、鈣超載等因素相關［13］。實驗結果表明，ISO誘發心臟衰竭的同時，增強血清SOD活性，增加TNF-α的含量，這表明ISO誘導心肌損傷的同時，造成強烈的心肌組織脂質過氧化作用，產生大量的自由基，損傷心肌組織。心力衰竭的形態學特點是心肌排列紊亂，大量炎性滲出和纖維增生，HE染色下，與對照組比較，ISO組中心肌細胞排列紊亂，有大量的心肌纖維增生并伴有炎性細胞滲出。Masson染色提示ISO組在排列紊亂的心肌細胞間有大量藍染膠原纖維增生，CVF亦提示模型組有較高心肌纖維增生。

近年來，隨著L-arg對心臟疾病的作用研究開展增多，有助于更進一步了解心肌疾病的發生機制，尋找新的治療方法。L-arg-NO通路，即L-arg在NOS的催化作用下生成L-瓜氨酸和NO。本實驗結果顯示，L-arg干預后明顯降低心肺參數，改善血流動力學參數，同時減輕心肌排列紊亂程度和膠原纖維增生，表明其對心力衰竭心肌有明顯的改善作用。心力衰竭時血清中的NO含量和NOS活性均降低，L-arg干預后，提高NO含量，增強NOS的活性。在正常生理情況下，心肌細胞表達的NOS以精氨酸為底物生成NO，NO擴散進入機體細胞后，在細胞中影響有關基因轉錄翻譯水平以及線粒體的氧化磷酸化功能，進而減輕心肌損害，產生保護心肌的作用［14］。與對照組比較，ISO增強SOD活性和TNF-α含量，增加心肌排列紊亂程度和膠原纖維含量，而L-arg顯著減輕上述改變。推測L-arg通過促進NO的產生，中和氧自由基，降低過氧亞硝酸陰離子生成，增強膜穩定和心肌收縮力，減輕心肌重構等方面保護心力衰竭心肌細胞。

綜上所述，提供外源性L-arg增強NOS活性，可以通過激活L-arg-NO通路，提高體內NO濃度，減輕心肌損害和重構，從而改善心力衰竭造成的心肌損害，具有廣闊的臨床應用前景。

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The effects of L-arginine on heart failure rats induced by isoprenaline through activating L-arg-NO pathway

Li Weijian，Fang Da，Liang Lijun，et al

（Clinical Medicine，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002）

ObjectiveTo explore the effects of L-arginine（L-arg）by activating L-arg-NO pathway on heart failure rats induced by isoprenaline（ISO）.MethodsMale SD rats were randomly divided into three groups：control group，ISO group，L-arg group.Heart failure model was made by injecting ISO and L-arg was given by gavage.After thirty days，each group was monitored with hemodynamic parameters by carotid artery intubation：heart rate（HR），left ventricular systolic pressure（LVSP），left ventricular end-diastolic pressure（LVEDP），maximal or minimal differentials of left ventricular developed pressure（±dp／dtmax）.Heart and lung indices were calculated.Superoxide dismutase（SOD），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and nitric oxide（NO）concentration and nitric oxide syntheses（NOS）activity in plasma of each group were determined.Myocardial tissue changes were analyzed by HE staining.Myocardial fibers changes and collagen volume fraction（CVF）were analyzed by Masson trichrome staining.ResultsHR，LVSP and+dp／dtmaxin L-arg group were higher than those in ISO group；LVEDP and -dp／dtmaxin L-arg group were lower than that in ISO group（P＜0.05）.L-arg decreased the heart and lung indices（P＜0.05）.Meanwhile，the TNF-α and SOD level of L-arg group were decreased than those of ISO group（P＜0.05）.At the same time，the NO concentration and NOS activity of L-arg increased than those of ISO group（P＜0.05）.The myocardial arranged disorder，lots of inflammatory cells and interstitial collagen due to isoprenaline injection，L-arg supplements improved the heart function induced by ISO.There were a large number of blue-stained collagen fibers among derangement of myocardial cells in ISO group.But there was rarely the blue-stained region in the control group and L-arg group.CVF in ISO group was higher than L-arg group（P＜0.05），CVF in L-arg group was higher than the control group（P＜0.05）.ConclusionExogenous L-arg can protect heart failure myocardium through activating L-arg-NO pathway to activate NOS，increase NO concentration，reduce myocardial remodeling and improve cardiac function.

L-arg；L-arg-NO pathway；isoprenaline；heart failure

R 364.31

A

1000-1492（2015）12-1716-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.004.html

2015-08-10接收

江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃（編號：201410313056X）；徐州醫學院院級科研課題（編號：2014KJ11）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：20130313021）

徐州醫學院1臨床醫學系、2機能實驗中心，徐州 221002作者簡介：李偉建，男，本科生；

桑黎黎，女，實驗師，責任作者，E-mail：sanglili1982＠163.com