豹紋鰓棘鱸病原鰻利斯頓氏菌的分離鑒定及生物學特性研究*

姚學良，徐曉麗，張振奎，丁子元，宋昀鵬，崔寬寬

(天津市水產技術推廣站，天津 300221)

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豹紋鰓棘鱸病原鰻利斯頓氏菌的分離鑒定及生物學特性研究*

姚學良，徐曉麗，張振奎，丁子元，宋昀鵬，崔寬寬

(天津市水產技術推廣站，天津 300221)

從患病的豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)的腎臟中分離到1株優勢菌33002，人工感染試驗證實其對豹紋鰓棘鱸有較強的致病性；采用形態學觀察、生理生化特性分析及16S rRNA和gyrB基因序列系統發育樹分析對菌株33002進行鑒定。結果顯示，菌株33002為革蘭氏陰性弧菌，生化特性與利斯頓氏菌屬的鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)相近，基于gyrB基因序列的系統發育分析,菌株33002與鰻利斯頓氏菌聚為一支。對48種抗生素的藥敏結果顯示，菌株33002對紅霉素、阿奇霉素等25種藥物敏感，對恩諾沙星、桿菌肽等22種藥物不敏感。

豹紋鰓棘鱸；鰻利斯頓氏菌；生理生化特性；16S rRNA；gyrB

豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)俗稱東星斑、花斑刺鰓鮨、豹鲙，隸屬鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鰓棘鱸屬(Plectropomus)，主要分布于西太平洋至印度洋海區，北自日本南部，南至澳洲，東自斐濟，西到非洲東岸、紅海等地。豹紋鰓棘鱸肉質鮮美，含有二十幾種人體所需微量元素及維生素，營養價值高，價格昂貴，在國際市場上深受歡迎，市場前景廣闊。隨著豹紋鰓棘鱸人工繁殖技術的突破，該魚已成為南方沿海特別是海南沿海的后備養殖品種，并由南向北擴展。由于豹紋鰓棘鱸養殖歷史短，針對該魚的研究報道較少，多集中于對其人工繁育及胚胎發育、環境因子對幼魚的生長影響等研究[1-3]，在疾病方面鮮有報道。

鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)是水產養殖動物中常見且重要的病原菌，已知能夠感染50多種海淡水養殖動物，給水產養殖業帶來嚴重危害[4-5]。本研究從患病豹紋鰓棘鱸腎臟分離到病原菌，經鑒定為鰻利斯頓氏菌，對其進行理化特性、致病性、抗菌藥物敏感性及16S rRNA基因與gyrB基因系統發育分析，豐富了鰻利斯頓氏菌的相關研究資料，并為豹紋鰓棘鱸細菌性疾病的檢測及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病豹紋鰓棘鱸取自天津盛億水產養殖有限公司，體質量25～35g，人工感染用健康豹紋鰓棘鱸購自天津市海發海珍品股份有限公司，體質量(27±3)g，暫養1周后用于人工感染實驗，飼養期間采用充氣泵增氧，每日投餌2次，吸污1次，換水1/2，保持實驗期間水溫20℃，鹽度25。2216E瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基、細菌微量生化反應管及細菌藥敏紙片等均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 細菌分離

無菌條件抽取有明顯癥狀的豹紋鰓棘鱸腹水滴片進行革蘭氏染色，觀察細菌典型形態，從病魚腎臟中分離細菌，分別劃線接種于2216E瓊脂、TCBS培養基上，于28℃培養24h，挑取形態一致的優勢菌落進一步純化，獲得純培養的菌株，轉接于TSB液體培養基中培養24h，加15%甘油于-80℃冰箱中保存。

1.3 人工感染實驗

將純培養菌接種于TSB培養基，28℃培養過夜，0.85%NaCl洗滌3次，菌懸液濃度調至3×107cfu/mL做為供試菌液，待用。感染實驗分2組，每組6尾豹紋鰓棘鱸。試驗組腹腔接種供試菌液，每尾0.2mL；對照組注射等量0.85% NaCl；每天觀察記錄實驗魚感染后的發病及死亡情況，期間每天正常飼養并換水，并取癥狀典型的實驗魚再次進行細菌分離鑒定。以引起試驗魚發病死亡并能重新分離到感染菌作為分離菌致病與否的判定指標。

1.4 細菌鑒定

1.4.1 形態與菌落特征觀察及理化特性檢查 取純培養菌接種于2216E瓊脂于28℃培養20h，制備涂片標本進行革蘭氏染色觀察細菌形態特征；參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《人及動物病原細菌學》[6-7]進行細菌氧化酶、糖(醇及苷)類代謝、H2S、吲哚、甲基紅、V-P試驗、硝酸鹽還原、枸櫞酸鹽利用等理化特性測定。

1.4.2 16S rRNA和gyrB基因序列測定與系統發育分析

PCR模板的制備 取1mL菌液12000r/min離心1min，棄上清，沉淀重懸于100μL無菌蒸餾水中，煮沸5min后迅速冰浴10min，12000r/min離心5min，取上清作為PCR反應模板。

16S rRNA基因序列的PCR擴增 采用通用引物B27F：5′-AGA GTT TGA TCM (C) TGG CTC AG-3′與1492R:5′-ACG GY(C)TAC CTT GTT ACG ACT T-3′擴增細菌的16S rRNA[8]，反應條件為：95℃預變性3min，94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min，30個循環后72℃延伸10min。PCR擴增產物送至上海生物工程技術公司進行基因序列測定。

gyrB基因序列的PCR擴增與測序gyrB基因擴增的引物為：UP1(正向引物)，5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3′；UP2r(反向引物)，5′-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3′[9]。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min，30個循環后72℃延伸7min。PCR產物送至上海生物工程技術公司進行基因序列測定。

16S rRNA和gyrB基因序列系統發育樹構建 將分離細菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(http://www. ncbi. nlm.nih. gov/Blast/)進行序列同源性分析，并從中選取相關的16S rRNA基因和gyrB基因序列，采用Clustal X軟件進行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，分別以16S rRNA基因和gyrB基因序列為遺傳標記，用MEGA5.1采用鄰接法(Neighbor joining method)構建系統發育樹，通過自舉分析檢測置信度(1000次重復)。

1.5 藥物敏感性測定

所分離菌株的藥敏實驗采用常規瓊脂擴散(K-B)法進行，調整菌液濃度為1.5×108cfu/mL均勻涂布于平板，將選定的48種抗生素藥敏紙片貼于平板上，于28℃培養24h觀察，記錄各抑菌圈直徑(mm)，按照藥敏紙片使用說明中的抑菌范圍解釋標準判斷實驗結果。

2 結果

2.1 病魚癥狀及病原菌分離

病魚體表鱗片脫落、潰爛，腹部膨大，有腹水，肝貧血，腎潰爛呈乳白色小米粒狀(見圖1)。在患病豹紋鰓棘鱸腹水中，存在大量革蘭氏陰性弧菌，細菌散在或成雙排列，兩端鈍圓(見圖1)。從病魚腎臟中也分離到了同種形態細菌，在2216E上培養24h后形成圓形光滑、不透明、隆起、乳白色、邊緣整齊的菌落，在TCBS上形成黃色菌落。在TSB培養基中呈均勻混濁生長，管底有點狀菌體沉淀，且有菌膜形成。取單菌落做純培養，編號33002。

圖1 人工感染發病魚癥狀圖及鰻利斯頓氏菌菌落形態圖Fig.1 The symptom of diseased fish with virulence test and colony morphology diagram of L.anguillarum

2.2 分離菌的致病性

試驗組的豹紋鰓棘鱸于感染4d后陸續死亡，并出現明顯的體色變淺、體表潰爛、輕度腹水、肝臟貧血等癥狀，10d后試驗組魚全部死亡。對照組豹紋鰓棘鱸在14d觀察期內不表現出任何癥狀，無一死亡；從感染死亡魚的腎臟分離細菌，純培養后進行鑒定，結果顯示再次分離的菌株與原感染菌的形態特征、理化特性及16S rRNA基因序列均一致，證明所分離菌株33002為本次引起豹紋鰓棘鱸死亡的病原菌，且具有較強的致病性。

2.3 理化性狀

菌株33002的生理生化結果見表1，與鰻利斯頓氏菌的生理生化特征基本一致，初步判定菌株33002為利斯頓氏菌屬(Listonella)的鰻利斯頓氏菌(L.anguillarum)。

表1 菌株33002和鰻利斯頓氏菌的生理生化特征的比較Table 1 Comparison of physiological and chemical characteristics of strain 33002 and L. anguillarum

2.4 16S rRNA和gyrB基因序列與系統發育分析

對菌株33002進行16S rRNA和gyrB基因序列的擴增，經序列測定和同源比對，菌株33002與鰻利斯頓氏菌(L.anguillarum)、病海魚弧菌(V.ordalii)、創傷弧菌(V.vulnificus)及河口弧菌(V.aestuarianus) 16S rRNA基因序列相似性均在97%以上。選擇乳房鏈球菌16S rRNA基因序列(登錄號：U41048)作為外圍菌將分離菌與檢索出的部分弧菌菌株的16S rRNA基因序列進行系統發育分析，結果顯示菌株33002與鰻利斯頓氏菌、病海魚弧菌聚為一支，置信度為99%(見圖2)；菌株33002的gyrB基因序列與鰻利斯頓氏菌(L.anguillarum)的相似性為99%，遠高于與擬態弧菌(V.mimicus)、霍亂弧菌(V.cholerae)、河口弧菌(V.aestuarianus)等的相似性(86%以下)，選擇乳房鏈球菌gyrB基因序列(登錄號：AB238638)作為外圍菌構建的基于gyrB基因的系統發育樹將菌株33002與鰻利斯頓氏菌聚為一支(見圖3)。結合形態觀察、生理生化特征、16S rRNA和gyrB的分子鑒定結果，判定分離菌33002為鰻利斯頓氏菌。

2.5 藥物敏感性

分離菌對供試的48種抗菌藥物中的恩諾沙星、制霉菌素、苯唑青霉素、桿菌肽等22種藥物耐藥，對復方新諾明中度敏感；對紅霉素、阿奇霉素、諾氟沙星、氟苯尼考等25種藥物敏感(見表2)。

圖2 以16S rRNA基因構建的L. anguillarum系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of L. anguillarum based on 16S rRNA genes

抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity復方新諾明SMZ+TMP75I苯唑青霉素Oxacillin1R紅霉素Erythromycin15S多黏霉素BPolymyxinB300UR阿奇霉素Azithromycin15S羅紅霉素Roxithromycin15R鏈霉素Streptomycin10S呋喃唑酮Furazolidone30R恩諾沙星Enrofloxacin5R左氟沙星Levofloxacin5S四環素Tetracycline30S制霉菌素Nystatin100R奧復星Ofloxacin5S鏈霉素Streptomycin300S丁胺卡那霉素Amikacin30R新生霉素Novobiocin30R桿菌肽Bacitracin0.04UR強力霉素Doxycycline30S阿洛西林Azlocillin75S麥迪霉素Midecamycin30R吉他霉素Kitasamycin15R克拉霉素Clarithromycin15R

續表2

抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity慶大霉素Gentamicinum10R慶大霉素Gentamicinum120S阿莫西林Amoxicillin10R潔霉素Jiemycin2R克林霉素Clindamycin2R甲氧芐啶Trimethoprim5S環丙沙星Ciprofloxacin5S氯霉素Chloromycetin30S頭孢氨芐Cephalexin30R哌拉西林Piperacillin100S哌拉西林Piperacillin10S痢特靈Furazolidone300R磺胺異噁唑Sulfafurazole300S氟苯尼考Florfenicol75S淋必治Spectinomycin100S諾氟沙星Norfloxacin10S氨芐西林Ampicillin10R頭孢呋辛Cefuroxime30R頭孢克洛Cefaclor30S萬古霉素Vancomycin30R頭孢曲松Rocephin30S先鋒霉素ⅤCephalosporinⅤ30R頭孢哌酮Cefoperazone75S利福平Rifampicine5SO/12910SO/129150S

注：R： 耐藥；I：中度敏感；S：敏感；U：酶活力單位。Note：R:Denotes low or no sensitivity;I:Denotes moderate sensitivity;S:Denotes high sensitivity;U:Unit of enzyme activity.

3 討論

鰻利斯頓氏菌對水產養殖動物的危害由來已久，是歐洲文獻記載中最早的魚類病原菌(Bonaveri 1761)，在1718年就有對鰻鱺“紅疫(red-pest)”的詳細記錄，1893年意大利學者Canestrini首次從患“紅疫”病的鰻鱺體內分離到該菌，1909年Bergeman從瑞典暴發“紅疫”病的鰻鱺中分離到該菌并首次命名為鰻弧菌，1985年MacDonell和Colwell等建議將該菌由弧菌屬(VibrioPacini 1954)歸入利斯頓氏菌屬(Listonella)，命名鰻利斯頓氏菌。鰻利斯頓氏菌呈世界性分布，已有報導能夠引起大麻哈魚、硬頭鱒、大菱鲆、鰻魚、太平洋鮭、香魚、鰤魚、竹莢魚、真鯛、鱸魚、鰈魚、鱈魚、許氏平鲉、鮐魚以及蝦、蟹、牡蠣等多種水產養殖動物發生“弧菌病”[5，10-17]。隨著人工養殖水產動物種類的增加，養殖密度的增加及漁藥濫用導致的鰻利斯頓氏菌耐藥性和遺傳變異的加劇，該菌的宿主范圍不斷在擴大，致病性及環境耐受力也在逐漸增強，可能引起更嚴重的病害。本次從豹紋鰓棘鱸體內分離到鰻利斯頓氏菌，并經人工感染試驗證實其為本次疾病的致病菌，進一步表明該菌在水體中的廣泛分布及在水產動物的強致病性。

16S rRNA基因序列分析是目前最常用的細菌鑒定和系統發育分子遺傳標記，但研究表明16S rRNA基因的水平轉移及同一基因在不同進化分支中進化速度有差異，適合屬以上分類階元的親緣關系研究，對屬以下的分類單位分辨率不足[15]。gyrB基因存在于大多數細菌中不同的蛋白及蛋白的不同位點，其氨基酸替代率也不相同，并且不會發生頻繁的水平轉移[18]，在近緣種和菌株的區分及鑒定方面與16S rRNA相比更具優越性。本研究對分離菌33002分別進行了16S rRNA和gyrB兩種基因的分子鑒定，比較了16S rRNA和gyrB兩種基因對鰻利斯頓氏菌的鑒別能力。分離菌33002 16S rRNA基因序列通過blast檢索，序列相似性較高的為鰻利斯頓氏菌、病海魚弧菌、創傷弧菌及河口弧菌等，相似性均在97%以上，在系統發育樹中33002與上述鰻利斯頓氏菌和病海魚弧菌聚為一個類群，未能將分離菌鑒定到種。分離菌33002gyrB基因序列通過blast檢索，與鰻利斯頓氏菌的gyrB基因序列相似性達99%，與其他弧菌的gyrB基因序列的相似性均在86%以下，且在系統發育樹中33002與鰻利斯頓氏菌聚為一個類群，gyrB基因序列能將分離菌鑒定到種。本研究結果表明，在弧菌屬相似細菌的鑒別方面，gyrB比16S rRNA基因更具優越性。該項研究結果與張曉君等[16，19]的研究結論一致，對于細菌分離鑒定研究具有一定的指導意義。

在對鰻利斯頓氏菌的藥物敏感性研究方面，郭睿[20]從斜帶髭鯛上分離的鰻利斯頓氏菌對17種抗生素的敏感性顯示，對新生霉素、羅紅霉素等7種藥物敏感；對利福平、氨芐西林等8種抗生素耐藥。王庚申等[21]以25種抗菌類藥物對從許氏平鲉上分離的鰻利斯頓氏菌進行藥物敏感性測定，發現其對新生霉素、克拉霉素等9種抗生素藥物高度敏感；對慶大霉素、復方新諾明等4種藥物中度敏感；對青霉素、氨芐青霉素等12種藥物具有抗性。本研究測定了分離菌對48種常用抗菌類藥物的敏感性，結果表明菌株33002對恩諾沙星、制霉菌素、苯唑青霉素、桿菌肽等22種藥物耐藥；對復方新諾明中度敏感；對紅霉素、阿奇霉素、諾氟沙星、氟苯尼考等25種藥物敏感。而張曉君等[22]測定了從同批次大菱鲆分離的20株鰻利斯頓氏菌對37種常用抗菌類藥物的敏感性，結果發現供試菌株對其中27種抗菌藥物具有基本一致的敏感或耐藥性；對另外10種抗菌藥物表現出了或為高度敏感、或為敏感、或為耐藥的菌株間差異。這一結果顯示了鰻利斯頓氏菌不同分離株在對某些抗菌類藥物敏感性方面存在不一致性。本研究結果可作為鰻利斯頓氏菌感染時選擇用藥及對鰻利斯頓氏菌耐藥規律研究的參考，但由于其株間差異性的存在，建議有效用藥應是對每次發病病原菌進行藥物敏感性測定后再選擇敏感藥物為宜。

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責任編輯 朱寶象

IIsolation of Pathogenic Listonella anguillarum from Plectropomus leopardus and its Biological Characterization

YAO Xue-Liang, XU Xiao-Li, ZHANG Zhen-Kui, DING Zi-Yuan, SONG Yun-Peng, CUI Kuan-Kuan

(Tianjin Fishery Technical Extension Station, Tianjin 300221, China)

A dominant bacterium nominated as 33002 was isolated from the kidney of diseasedPlectropomusleopardus. It was strongly pathogenic toP.leopardusby artificial challenge. The bacterium was characterized according to its morphological, physiological and biochemical characteristics, and 16S rRNA andgyrB gene sequences. In phylogenetic tree based ongyrBgene, 33002 was clustered withL.anguillarum. Antimicrobial susceptibility assay to 48 antimicrobial agents showed that 33002 was susceptible to 25 agents including erythromycin, azithromycin and florfenicol, but highly resistant to 22 agents including fnrofloxacin, bacitracin and furazolidone. These findings supported our identification of 33002 as a strain ofListonellaanguillarum.

Plectropomusleopardus;Listonellaanguillarum; physiological and biological characteristics; 16S rRNA gene;gyrB gene

天津市科技支撐計劃項目(12ZCZDNC00900)資助

2014-03-02；

2014-09-12

姚學良(1982-)，女，碩士，工程師，主要從事水產動物病害防治及水產養殖技術的研究和推廣工作。E-mail：tjyaoxueliang@126.com

S941.42+9

A

1672-5174(2015)05-039-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140040