CD44v6和FOXD3在人胃癌組織中的表達及臨床意義

陳 勇，張 紅，吳夢婕，姚元春，楊春香，秦 蓉

CD44v6和FOXD3在人胃癌組織中的表達及臨床意義

陳 勇1，張 紅1，吳夢婕2，姚元春3，楊春香4，秦 蓉1

目的研究CD44v6和FOXD3蛋白在人胃癌組織中的表達及其與胃癌生物學行為的關系。方法采用免疫組化Envision二步法檢測兩種蛋白在100例人胃癌組織及40例癌旁正常胃黏膜組織和110例人胃癌組織芯片中的表達。結果傳統病理切片中CD44v6蛋白在胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織的陽性表達率分別為88%、22.5%（P＜0.001），與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關（P＜0.001）。FOXD3蛋白在胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織的陽性表達率分別為22%、90%（P＜0.001），與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關（P＜0.001）。CD44v6與FOXD3表達呈顯著負相關性（rs＝-0.276，P＜0.01）。CD44v6和FOXD3在110例胃癌組織芯片中的表達結果與以上傳統切片中的表達情況相似。結論FOXD3作為干細胞因子，其與胃癌生物學行為的關系以及與CD44v6的相關性提示FOXD3可能作為胃癌干細胞標記物。

CD44v6；FOXD3；胃癌；干細胞；免疫組織化學；組織芯片

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤細胞中數量極少的特殊細胞亞群，這種細胞亞群能夠產生不同表型的腫瘤細胞，并維持腫瘤細胞的惡性增殖［1］。CSCs可表達一些干細胞特異性標記因子，提示干細胞因子可能參與腫瘤的形成或者是腫瘤細胞的標記物［2］。CD44是一種細胞表面黏附因子，目前主要以其作為胃癌干細胞表面標志物進行胃癌干細胞研究。CD44v6是CD44主要變體之一，在腫瘤細胞的侵襲及轉移中起重要作用。FOXD3是叉頭框（Forkheadbox，Fox）家族成員之一，是一種干細胞關鍵轉錄因子，具有保持胚胎干細胞多能性等作用［3］。目前FOXD3與胃癌的關系及FOXD3與CD44v6的關系研究甚少。該研究通過分析FOXD3在胃癌組織中的表達情況及CD44v6與FOXD3蛋白表達的相關性，探討FOXD3作為胃癌干細胞標記物的可能性，為胃癌臨床診斷及治療提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 第一部分標本來源 收集2013年安徽醫科大學第一附屬醫院病理科胃癌手術切除標本100例，所有病例術前未接受放化療。其中男77例，女23例；年齡36～78（61.34±8.30）歲。收集癌旁正常胃黏膜組織40例作為對照。病例按WHO胃癌組織學分期標準歸類。

1.1.2 第二部分標本來源 選取1982～2002年美國弗吉尼亞大學醫學院病理系胃癌存檔病例125例，以及安徽醫科大學第一附屬醫院病理科胃癌手術切除標本60例，共185例（組織芯片由張紅副教授饋贈）。病例術前均未接受放化療。將上述兩組胃癌標本分別制成2張組織芯片。實際有效病例110例，其中男82例，女28例；年齡25～86（40.26 ±13.25）歲。癌旁正常胃黏膜組織對照同第一部分。病例按WHO胃癌組織學分期標準歸類。

1.2 主要試劑鼠抗人CD44v6單克隆抗體（即用型）、PV-6000免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；鼠抗人FOXD3單克隆抗體（濃縮型，工作濃度1∶200）購自美國abcam公司。

1.3 實驗方法所有切片采用相同條件按試劑盒說明書方法進行操作。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機選擇5個高倍視野（×400），采用半定量積分法［4］判斷陽性結果（陽性面積和強度共同判斷）。陽性面積判斷：視野陽性細胞數≤5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，＞75%計為4分；陽性強度判斷：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項積分相乘：0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。為便于統計，將≥3分（+～+++）均判斷為陽性表達。染色結果均由兩位病理科醫師閱片診斷核實。

1.4 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，定量資料采用表示，統計分析使用t檢驗。等級資料采用秩和檢驗，相關關系分析采用Spearman檢驗。

2 結果

2.1 傳統病理切片中CD44v6在胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況及其與胃癌臨床病理參數之間的關系CD44v6蛋白陽性信號主要定位于細胞膜，染色呈棕黃（褐）色，細胞膜連續線狀或帶狀分布為陽性細胞，見圖1。CD44v6在胃癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，差異有統計學意義（χ2＝57.601，P＜0.001），見表1。CD44v6在胃癌組織中的表達水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移及臨床TNM分期相關（P＜0.001），與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關性，見表2。

2.2 傳統病理切片中FOXD3在胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況及其與胃癌臨床病理參數之間的關系FOXD3蛋白的陽性信號主要定位于細胞核，呈棕黃（褐）色細顆粒狀，見圖1。正常胃黏膜組織中FOXD3蛋白陽性表達率明顯高于胃癌組織，差異具有統計學意義（χ2＝54.446，P＜0.001），見表1。FOXD3蛋白的表達水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移及臨床TNM分期相關（P＜0.001），與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關性，見表2。

表1 傳統病理切片中CD44v6和FOXD3在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達情況

2.3 傳統病理切片中CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織中表達的相關性傳統病理切片中，CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織的表達經Spearman等級相關分析處理后顯示：兩者差異有統計學意義，且兩者呈顯著負相關性（rs＝-0.276，P＜0.01）。

2.4 組織芯片標本中CD44v6在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達情況及其與胃癌臨床病理參數之間的關系CD44v6在胃癌組織中陽性表達主要分布在癌巢外周或呈彌漫分布，脈管內轉移的癌細胞也可見CD44v6的陽性表達。CD44v6在胃癌組織中陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織，差異有統計學意義（χ2＝7.461，P＜0.01），見表3。此結果與傳統病理切片中CD44v6的陽性表達結果基本一致。CD44v6在胃癌組織中的表達水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移及臨床TNM分期相關（P＜0.05），與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關性，見表4。

表2 傳統切片中CD44v6和FOXD3蛋白表達與胃癌臨床病理參數間關系（n）

2.5 組織芯片標本中FOXD3在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達情況及其與胃癌臨床病理參數之間的關系FOXD3蛋白陽性表達率在正常胃黏膜組織中明顯高于胃癌組織，差異具有統計學意義（χ2＝41.153，P＜0.001），見表3。此結果與傳統病理切片中FOXD3的陽性表達結果基本一致。FOXD3蛋白的表達水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移及臨床TNM分期相關（P＜0.05），而與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關性，見表4。

表3 組織芯片標本中CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達情況

2.6 組織芯片標本胃癌組織中CD44v6和FOXD3蛋白表達的相關性組織芯片標本中，CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織中的表達經Spearman等級相關分析后顯示：兩者表達的差異有統計學意義，且兩者呈顯著負相關性（rs＝-0.585，P＜0.001）。此結果與傳統病理切片結果基本一致。

3 討論

研究［5-6］表明，CSCs可能是導致惡性腫瘤發生、侵襲、轉移、復發和放化療治療抵抗的主要原因。腫瘤的治療過程中，CSCs的不完全消滅能夠引起腫瘤的復發。由CSCs理論可知，當前的腫瘤治療應該針對CSCs，只有完全殺死CSCs，使腫瘤的增殖能力下降，導致腫瘤退化、消失，從而達到真正治愈腫瘤的目的。

最近的研究［7］顯示，在胃癌細胞株中存在CD44+和CD44-細胞亞群，CD44+細胞成瘤能力遠高于CD44-細胞，且具有自我更新和抵抗放化療能力。支持CD44作為胃癌干細胞的重要標記物，可用于識別胃癌干細胞。在胃癌細胞系SCG-7901中，如果敲除CD44v6基因，腫瘤的轉移及侵襲能力明顯受到抑制［8］。CD44v6可能誘導了胃癌的轉移和侵襲。FOXD3最早是在1996年由Sutton et al［3］從小鼠胚胎瘤細胞文庫中分離，證實FOXD3可以維持胚胎的發育并保持胚胎干細胞的多能性，這一作用很可能是其作為一種轉錄抑制子，通過抑制胚胎干細胞中起分化作用基因的轉錄來維持胚胎干細胞的多能性。隨著對FOXD3在CSCs中的不斷深入研究，其與胃癌關系的研究也備受關注。

表4 組織芯片標本中CD44v6和FOXD3蛋白表達與胃癌臨床病理參數間關系（n）

本研究通過免疫組化法檢測并分析CD44v6和FOXD3與胃癌生物學行為的關系，結果顯示無論是傳統病理切片還是組織芯片標本，CD44v6蛋白表達均隨著腫瘤浸潤程度的加深、淋巴結轉移的出現而增強且Ⅲ～Ⅳ期陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期，FOXD3蛋白表達則隨著腫瘤浸潤程度的加深、淋巴結轉移的出現而減弱且Ⅲ～Ⅳ期陽性率低于Ⅰ～Ⅱ期，兩者均與患者性別、年齡、腫瘤大小無關。研究［9］顯示CD44v6是通過AKT信號通路的介導，調控腫瘤細胞的生長，與多種惡性腫瘤相關。在卵巢癌中，CD44v6通過介導腫瘤細胞的黏附和遷移引起腫瘤的浸潤和轉移，且與腫瘤的復發有關［10］。CD44v6與胃癌生物學行為關系密切。研究［11］表明，FOXD3的表達下調RhoA-ROCK信號，抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲。FOXD3的表達受到絲氨酸-蘇氨酸激酶（B-RAF）抑制，作為細胞周期負調控因子抑制黑色素細胞的形成，進而影響腫瘤的形成［12］。在胃癌中，FOXD3可能通過負調控RhoA-ROCK信號通路抑制胃癌的浸潤及淋巴結的轉移。張沖等［13］提出，幽門螺桿菌（HP）感染促進胃組織腸上皮化生，誘導CD44v6的表達；螺桿狀HP及其球形體感染會導致胃黏膜中CD44v6表達的增加，進一步導致胃癌的發生［14］。CD44v6和FOXD3的表達在胃癌形成過程中可能具有負相關性。本實驗通過對實驗結果的統計分析，與推測結果一致。

目前，越來越多的證據［1，5］表明，腫瘤是一種干細胞疾病，是由CSCs增殖分化而來，CD44v6在CSCs研究中起到十分重要的作用。但就國內外研究現狀看來，CD44v6作為CSCs特異性標志物能否分離出CSCs尚不明確，其在腫瘤細胞中所起作用仍有待進一步證實。CSCs與干細胞十分相似，且許多干細胞因子在多種CSCs中均有表達，提示干細胞因子可能是有價值的CSCs表面標記物。FOXD3是一種干細胞因子，并且在決定胚胎干細胞正常還是惡性，增殖還是分化過程中起關鍵作用。根據目前的相關研究推測FOXD3可能是繼CD44v6另一種特異性胃癌干細胞表面標記物，并且在胃癌發生發展、浸潤轉移、分化增殖及凋亡中發揮重要的作用。FOXD3與CD44v6協同作用有利于純化CSCs，進而對CSCs進行靶向治療從而達到治愈腫瘤的目的。但至今國內外對FOXD3的研究較少，仍需大量的實驗闡明FOXD3的作用機制及其與腫瘤的關系。

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The expression and clinical significance of CD44v6 and FOXD3 in human gastric carcinoma

Chen Yong1，Zhang Hong1，Wu Mengjie2，et al
（1Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，The Affiliated Fuyang Hospital of Anhui Medical University，Fuyang 236000）

ObjectiveTo research the expressions of CD44v6 and FOXD3 protein in human gastric cancer tissue and the relation with the biologic behavior of gastric carcinoma.MethodsThe expressions of CD44v6 and FOXD3 in human gastric cancer and gastric normal tissue（100 cases of human gastric cancer，40 cases of gastric normal tissues and 110 cases of gastric cancer microarray）were detectd by immunohistochemistry Envision two step method.ResultsThe positive expression rate of CD44v6 in gastric cancer and nomal gastric tissue were respectively 88% and 22.5%（P＜0.001）in traditional tissue species，which were related with the depth of infiltration，the transfer of lymph gland and clinical stages（P＜0.001）.In the gastric cancer tissue and normal tissue adjacent to carcinoma，the expression rates of FOXD3 were respectively 22%and 90%（P＜0.001），which were also related with the depth of infiltration，the transfer of lymph gland and clinical stages（P＜0.001）.The relation between the expressions of CD44v6 and FOXD3 was significantly nagtively correlated（rs＝-0.276，P＜0.01）.The expression Results of CD44v6 and FOXD3 in gastric cancer tissue microarray were similar with that in the traditional pathologic section.ConclusionAs a stem cell，it is possible that FOXD3 serves as a marker of gastric stem cells concerning its relation with the biologic behavior of gastric cancer and its correlation with FOXD3.

CD44v6；FOXD3；gastric cancer；stem cell；immunohistochemistry；tissue microarray

R 735.2；R 341.32

A

1000-1492（2015）12-1795-05

時間：2015-11-18 10：12：35

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.040.html

2015-09-30接收

安徽省自然科學基金（編號：090413118）

1安徽醫科大學基礎醫學院病理學教研室，合肥 230032

2安徽醫科大學附屬阜陽醫院病理科，阜陽 236000

3吉首大學醫學院病理學教研室，吉首 416000

4安徽人口職業學院，池州 247100

陳 勇，女，碩士研究生；

張 紅，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ayzhanghong2013＠126.com