重組GST－β－GT融合蛋白的原核表達、純化及活性鑒定

郭慶棟 李慎濤 張玉祥 賈弘褆△

（1.首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系；2.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系 北京，100069）

在生物體內，糖基轉移酶催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的產物具有很多生物學功能［1］。T4噬菌體β葡糖基轉移酶能特異性地將尿嘧啶二磷酸葡萄糖（UDP－Glc）的葡萄糖單元轉移至雙鏈DNA的5－羥甲基胞嘧啶殘基上，形成β－葡萄糖基－5－羥甲基胞嘧啶［2］。T4噬菌體β葡萄糖轉移酶可通過克隆T4噬菌體β－GT基因的重組大腸桿菌獲得。T4噬菌體β葡糖基轉移酶對5－hmC殘基的定向修飾來區分5－mC和5－hmC。這種酶可以將所有5－hmC糖基化，產生5－ghmC。這個反應是序列無關的，因此所有5－hmC都將糖基化，而C或5－mC則不受影響［3］。

1 材料與方法

1.1 主要材料 T4噬菌體購于美國ATCC，大腸桿菌DH5α感受態細胞，pMD－18T載體、qPCR試劑 盒 購 于 Transgene 公 司，pGEX－6P－1 質 粒 和BL21（DE3）感受態細胞均為首都醫科大學基礎醫學院免疫學系李慎濤老師提供；質粒小提試劑盒購自Omega公司；核酸純化試劑盒購自MN公司；氨芐青霉素購自Sigma公司；限制性內切酶（BamH I、Xho I）購自 NEB公司，T4DNA聚合酶、連接酶、Ex Taq酶均購自 TAKARA 公司；Glutathione Sepharose－4B層析柱購自GE公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體β－GT基因的PCR擴增 從NCBI數據庫獲得噬菌體β－GT蛋白的基因序列，該序列的長度為1056bp，編碼392個氨基酸，并組裝修飾形成β－GT蛋白。根據β－GT蛋白基因的編碼序列，設計了上下游引物，由北京生工公司合成：上游引物： 5’－ATCGGGATCCAAAATTGCTATAATTAATATG－3’；下游引物：5’－AAGGCTCGAGTTATAAATCAATAGCTTTTTTGAACGCATC－3’；在上下游引物的5’端分別引入BamH I和Xho I酶切位點，利用飽和酚、氯仿、異戊醇進行噬菌體基因組DNA的提取和純化，用適量TE緩沖液將其溶解待用。以T4噬菌體基因組DNA為模板，用Ex Taq聚合酶進行PCR擴增（20μL反應體系）。擴增條件為：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃1min，35個循環；72℃10min，4℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠電泳圖像分析系統分析鑒定并用膠回收試劑盒回收PCR產物。

1.2.2 原核表達載體的構建 取適量的PCR產物和pMD－18T載體混合，加5μL T4－DNA 連接酶，16℃連接過夜。取適量連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，將轉化后的細菌涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12～16h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB液體培養基中，37℃振蕩培養12h，用堿裂解法提取質粒，并用BamHI和XhoI雙酶切鑒定。膠回收酶切的目的片段，克隆至原核表達載體pGEX－6P－1中，構建表達質粒 pGEX－6P－1－β－GT，轉化 E.coli BL21（DE3）感受態細胞，將轉化后的細菌涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養12～16h，挑取單菌落接種于含100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，置37℃搖床振蕩培養12h，抽提質粒、酶切鑒定并測序驗證。

1.2.3 目的蛋白的誘導和表達鑒定 經酶切鑒定構建成功的重組工程菌，取上述轉化BL21（DE3）感受態后陽性克隆培養物100μL接種于5L含100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，在37℃振蕩至菌液OD600達到0.6～0.8，分別加入1mmol／L IPTG誘導后，收集菌液離心后用1／10體積PBS重懸，加5xloading buffer 100℃煮沸10min，冷卻后取20μL上樣，進行10%SDS－PAGE電泳（100V20min，150 V 1h）。考馬斯亮藍染色15min，脫色液脫色5～12h，觀察結果。

1.2.4 蛋白的純化 通過比較不同誘導時間和IPTG濃度后，確定最佳誘導條件，即1mmol／L IPTG，誘導4h。將重組工程菌接種于LB培養基中，37℃過夜培養，次日細菌活化后，按照1∶100比例稀釋后加入500mL LB液體培養基中，進行大量表達。收集菌體后，用PBS重懸菌體，加入溶菌酶（終濃度至1g／L）、DTT（終濃度至1mmol／L）、PMSF（終濃度至1mmo／L），冰上作用30min，然后在冰浴上超聲至菌體完全裂解，15 000r／min離心30min。收集上清加入Glutathione Sepharose－4B親和層析柱中，讓其緩慢通過3～4次，用PBS沖洗5～10個柱床體積，最后用10mmol／L還原型谷胱甘肽（溶于50mmol／L Tris－HCl pH 8.0中）洗脫，并依次收集。

1.2.5 活性鑒定 用此蛋白對于5－hmC含量豐富的基因組進行糖基化處理，用NEB公司的T4－β－GT酶作為陽性對照，未做處理的樣品作為陰性對照，37℃12～16h，然后再用Msp I酶進行酶切，37℃作用16h，40℃蛋白酶K消化30min后，95℃熱失活10min。以此處理后的樣品作為模板，設計引物，進行qPCR鑒定。

1.2.6 統計學方法 實驗數據均以平均值±標準差（ˉx±s）形式表示，每組實驗設置3個平行，獨立重復3次。數據處理采用Graph Prism 5軟件處理，t檢驗分析，以P＜0.05示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 β－GT片段的擴增 提取噬菌體基因組DNA，以噬菌體基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR產物電泳結果顯示在1 100bp左右有一條帶，與β－GT片段的1 056bp大小基本一致且沒有非特異性條帶，經序列測定確認，此條帶序列與目的序列完全吻合，見圖1。

2.2 TA克隆 將PCR產物與pMD－18T載體連接產物轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，隨機挑取菌落，抽提質粒，用Xho I單酶切產物電泳，陽性克隆條帶位于3 856bp處；用BamH I和 Xho I進行雙酶切產物電泳后，陽性克隆出現的兩條帶分別位于約2 800bp和1 056bp處，見圖2。

2.3 原核表達載體的構建 用質粒提取試劑盒抽提原核表達質粒，用Xho I單酶切產物電泳，陽性克隆條帶位于6056bp處，用BamH I和Xho I進行雙酶切產物電泳后，陽性克隆出現的兩條帶分別位于約5 000bp和1 056bp處，見圖3。

2.4 GST－β－GT融合蛋白的誘導表達 將構建好的表達載體轉化至BL21（DE3）感受態細胞中，加不同濃度的IPTG誘導后繼續培養6h，誘導前后所收菌液分別取樣用10%SDS－PAGE膠和考馬斯亮藍染色方法進行鑒定，0.8mM、1.0mM 和1.2mM IPTG誘導目的蛋白均有高表達，1.0mM 和1.2mM IPTG誘導效果接近，但明顯比0.8mM IPTG誘導效果好，最后將IPTG誘導濃度定在1.0mM，見圖4。

2.5 GST－β－GT 融 合 蛋 白 的 表 達 和 純 化 用1.0mM IPTG誘導表達，將菌體超聲破碎、離心后，收集上清；利用 Glutathione Sepharose－4B親和層析柱進行純化，用10mM還原性谷胱甘肽洗脫，組分收集，用SDS－PAGE鑒定各組分。如圖5所示，在第4～7管中，目的蛋白純度較好達95%。合并含有純目的蛋白的組分，用蛋白濃縮管濃縮至適當的濃度，－80℃保存備用。

2.6 GST－β－GT融合蛋白的活性鑒定 用純化后的目的蛋白對5－hmC含量豐富的基因組進行糖基化處理，用NEB公司購買的T4－β－GT酶作為陽性對照，未做處理的作為陰性對照，qPCR進行鑒定，以NEB公司購買的T4－β－GT酶的活性為100%作為陽性對照，未做處理活性為1%作為陰性對照，測定GST－β－GT融合蛋白的活性為77.2%，與購買的T4－β－GT酶活性差異無統計學意義，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.001），GST－β－GT融合蛋白有糖基化酶活性，見圖6。

3 討 論

1952年就有文獻［4］報道哺乳動物DNA胞嘧啶堿基存在兩種修飾：5－甲基胞嘧啶（5mC）和5－羥甲基胞嘧啶（5hmC）。5hmC是繼5－甲基胞嘧啶5mC之后發現的第六種堿基，已在多種哺乳動物組織和細胞中檢出。與5mC相比，5hmC的含量更低，但5hmC也具有非常重要的生物學功能。5hmC參與了染色體重新編程、基因表達的轉錄調控，并在DNA去甲基化過程中發揮重要作用［5］。5hmC可能與特定腫瘤的發生密切相關，可能成為腫瘤早期診斷的生物標志物。因此準確高效的5hmC檢測技術至關重要，而β－GT酶為5hmC檢測技術提供了重要的支撐［6］。β－GT酶是T4噬菌體產生的一種蛋白質，具有高度選擇性和高效性，可特異性地將尿苷二磷酸葡萄糖的糖基轉運至5－hmC生成5－gmC，而不能將糖基轉運至5－mC［7］。5－mC可以被Tet酶氧化，而5－gmC則不能被Tet酶催化。TABSeq方法是通過β－GT酶和Tet酶兩種酶的共同作用，再經亞硫酸鹽測序將5－hmC和5－mC區分開來［8］。甲基化依賴的限制性內切酶 MspI和HpaII可識別同樣的序列（CCGG），但它們對甲基化狀態的敏感性不同：MspI識別并切割5mC和5hmC，但不能切割5－ghmC；HpaII只切割完全未修飾的位點，胞嘧啶上的任何修飾（5mC，5hmC，5－ghmC）均阻礙切割［9］。若CpG位點含有5hmC，那么糖基化、酶解之后能檢測到條帶，未糖基化對照反應中沒有條帶；同時可采用qPCR進行定量分析［10］。

本研究成功構建了 pEGX－6P－1－GST－β－GT 融合蛋白的表達載體，能夠在大腸桿菌中高效表達目的蛋白，經GST親和層析柱純化可得到純的GST－β－GT融合蛋白。通過與NEB公司購買的T4－β－GT酶進行對照實驗，驗證了此GST－β－GT融合蛋白具有T4－β－GT酶的糖基化活性，可以將尿苷二磷酸葡萄糖的糖基轉運至5－hmC生成5－gmC，可作為糖基化酶為表觀遺傳學5－hmC和5－mC的研究提供便利。在初步研究中所發現的5－hmC修飾在基因組DNA雙鏈上所存在的非對稱分布現象在基因表達調控等生物學作用方面的作用，以及在體內生理條件下存在去羥甲基化的特異性酶促反應過程等［11］。我們相信在不遠的將來人們會對5－hmC修飾的意義會有更為深刻的認識，它有可能將會成為人們對于疾病表觀遺傳學研究的重要的里程碑。

（本文附圖見封三）

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