低氧血癥新生兒循環內皮細胞數量的變化及其臨床意義＊

龍海鋒，梁肖云，顧曉瓊△，張 喆，張 媛，尹玉萍

（1.廣州市婦女兒童醫療中心臨床檢驗部，廣東 510623；2：廣州醫科大學，廣東 廣州 510182）

低氧血癥新生兒循環內皮細胞數量的變化及其臨床意義＊

龍海鋒1，梁肖云1，顧曉瓊1△，張 喆1，張 媛1，尹玉萍2

（1.廣州市婦女兒童醫療中心臨床檢驗部，廣東 510623；2：廣州醫科大學，廣東 廣州 510182）

目的探討低氧血癥新生兒外周血循環內皮細胞（CECs）水平變化及其臨床意義。方法采用Hladovec計數法測定40例不同程度缺氧的低氧血癥患兒（低氧血癥組）及20例血氧分壓正常的健康新生兒（對照組）外周血CECs數量。結果低氧血癥組CECs為（0.910±0.422）×106/L與對照組比較，高于對照組的（0.180±0.100）×106/L，差異有統計學意義（t＝7.539，P＜0.05）；中度低氧血癥組CECs為（1.140±0.135）×106/L，高于輕度低氧血癥組的（0.540±0.127）×106/L，差異有統計學意義（t＝13.43，P＜0.05）；重度低氧血癥組CECs為（1.660±0.114）×106/L，高于中度低氧血癥組的（1.140±0.135）×106/L，差異有統計學意義（t＝7.698，P＜0.05）。結論外周血CECs數量可反映低氧血癥患兒缺氧嚴重程度，可作為低氧血癥的早期診斷指標，為臨床早期診斷、病情判斷及療效評估提供新的判斷依據。

循環內皮細胞； 低氧血癥； 新生兒

新生兒期是指自胎兒娩出后臍帶結扎時開始至出生后28 d之前。在此期間，胎兒身體各器官發育尚不成熟，適應外界環境能力差，極易患各種疾病，病死率高；低氧血癥則是其中最常見的病理表現之一。低氧血癥是指由于中樞神經系統疾患及支氣管、肺病變等通氣和（或）換氣功能障礙，而引起的血液中含氧不足，動脈血氧分壓（PaO2）低于同齡人正常下限時的病理狀態，主要表現為血氧分壓與血氧飽和度下降。由于腦細胞對缺氧極其敏感，持續的缺氧可對大腦產生不可逆損傷，因此早期診斷低氧血癥，對于臨床搶救危重癥患兒，尤其是早產兒、極低出生體質量兒具有重要意義［1］。本研究旨在通過計數40例不同缺氧程度的低氧血癥患兒外周血中循環內皮細胞（CECs）數量，初步探討低氧血癥新生兒外周血中CECs水平與缺氧程度的聯系及其臨床意義，從而為新生兒缺氧的有效診斷、治療及預后判斷提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年7～10月于廣州市婦女兒童醫療中心珠江新城院區新生兒科就診的低氧血癥新生兒40例，其中男24例，女16例，年齡為1～25d。參考急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）柏林定義，將患兒按氧合指數（PaO2/FiO2）分輕度低氧血癥組（輕度組，n＝20）、中度低氧血癥組（中度組，n＝15）和重度低氧血癥組（重度組，n＝5），各組PaO2/FiO2水平分別為200～300mm Hg、100～＜200mm Hg、＜100mm Hg［2］。另外選取本院同期血氧分壓正常（PaO2/FiO2＞300 mm Hg）的健康新生兒20例作為對照組，其中男11例，女9例，年齡為1～23d。低氧血癥組與對照組在年齡及性別方面的差異無統計學意義（P＞0.05）。用紫頭采血管（含EDTAK2）采集各受試者靜脈血5mL，排除存在溶血、渾濁等影響因素的標本。

1.2 主要試劑 二磷酸腺苷（ADP）購自普利生公司，山羊血清購自北京鼎國生物技術有限責任公司，兔抗人CD34抗體購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.3 方法 Hladovec計數法計數外周血CECs。（1）內皮細胞的分離：將采集的抗凝血標本離心20min（3 150r/min），收集上清液；將0.1%ADP溶液0.2mL加入上清液中，振蕩2 min；離心20min（3 150r/min），將離心后所獲之上清液以4 450r/min離心10min，棄上清液，收集的沉淀物即為CECs；將0.1mL生理鹽水加入沉淀物中，振蕩重懸后備檢［3］。（2）計數CECs：將重懸液充分混勻，取1滴加入血細胞計數池內，光學顯微鏡下計數9個大方格中的CECs數量。同一標本計數4次，取其平均值作為CECs檢測結果，CECs＝9個大方格的細胞數/0.9μL［3］。（3）內皮細胞的鑒定：采用免疫組化的方法檢測CD34抗體相關抗原［4］。將分離好的內皮細胞均勻涂布于一潔凈玻片上，用95%酒精固定15min，晾干待檢。PBS漂洗3次，經0.1%Triton破膜10min，用PBS洗3次，濃度為50 mmol/L甘氨酸淬滅20min；PBS洗3次，山羊血清封閉1h，PBS洗3次，然后加入稀釋（1∶200）CD34抗體，4℃濕盒過夜；用PBS洗3次。滴加二抗，室溫孵育1h，PBS洗3次。加入DAPI，反應15～20min；PBS洗3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。采用Pearson相關分析進行相關性分析。

2 結 果

2.1 CECs免疫熒光染色鑒定結果 免疫熒光染色結果顯示，未加一抗的實驗對照組未發現熒光染色細胞；熒光染色實驗組鏡下可見熒光染色細胞，內皮細胞CD34抗體相關抗原呈陽性反應，細胞胞漿中有黃綠色的熒光著色，整個細胞輪廓清楚。確定分離得到的細胞為CECs，見附圖1（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

2.2 低氧血癥組與對照組CECs比較 統計學分析顯示，低氧血癥組CECs數量多于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 各低氧血癥亞組CECs數量的比較 中度低氧血癥組CECs數量多于輕度低氧血癥組，重度低氧血癥組多于中度低氧血癥組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。Pearson相關分析顯示，低氧血癥患兒CECs數量與缺氧程度呈正相關（r＝0.954，P＜0.05）。

3 討 論

目前臨床上用于評價血管損傷的方法主要分為有創和無創兩大類，有創的檢測方法包括冠狀動脈造影，即觀察冠狀動脈對乙酰膽堿所誘發的內徑變化，這種方法創傷性大，不適于疾病早期階段觀察，且儀器要求較高。無創的檢測方法包括血管超聲檢測肱動脈血流介導的內皮依賴性血管舒張功能（FMD）、頸動脈中膜厚度（IMT）、臂踝脈搏波傳導速度（baPWV）、踝臂指數（ABI）、中心動脈壓（CAP）、增強指數（AI）、大動脈彈性指數（C1）和小動脈彈性指數（C2）等。這些方法雖具有安全、實時、無創等優點，但對設備要求高。因此，探尋一種新的無創性血管損傷評價標志物迫在眉睫［5］。本課題采用的外周血CECs計數具有無創傷性、取材方便、操作簡便、靈敏度高、結果直觀等特點，為病理情況下非創傷性評價血管內皮情況開辟了新的路徑。

CECs由受損的血管內皮細胞脫落于外周血形成，在健康人外周血中數量極少。當機體發生缺氧時，血流動力學會發生明顯變化，使得機體某些臟器出現相應病理改變，導致血管內皮受損，進而引起一系列級聯反應，如組織因子表達增加，上調內皮細胞黏附分子，白細胞黏附、移行，血管內皮細胞變性、壞死，并脫落進入血循環，進而形成CECs［6］。多項研究表明，在炎癥、免疫應答、心血管疾病等情況下，CECs數量明顯增加，且由于決定CECs水平的因素較為單一，基本只受血管內皮損傷的影響［5］，因此可作為敏感、特異的指標直接反映血管內皮的損傷程度［7］。目前，CECs被認為是唯一一種直接研究活體血管內皮損傷的非創傷性指標，其在探索活體血管內皮的特性和功能、協助診斷相關疾病、判斷病情以及療效評估等方面的應用受到越來越廣泛的關注。

本研究采用了Hladovec法對血漿中的CECs進行分離，其原理是利用血液中各細胞成分的不同比重，用不同的離心力從血漿中分離出CECs。本法的優勢在于對實驗室條件要求簡單，僅需離心機、血細胞計數板、ADP等簡單的器材和試劑，在一般實驗室均可完成，從某種程度上極大地促進和推動了CECs研究在臨床上的應用。

免疫熒光檢測是鑒定CECs的最可靠的方法［8］。CECs表現為CD34＋［9］。實驗中為證實本研究檢測到的是CECs。本研究對涂片中的細胞進行了間接免疫熒光檢測，熒光染色結果顯示內皮細胞的黃綠色特異性熒光位于細胞的膜和胞漿，表明所觀察到的免疫熒光細胞是CECs。

本研究通過計數40例不同缺氧程度的低氧血癥新生兒外周血CECs數量發現，健康新生兒外周血中僅存在極少量CECs，而低氧血癥患兒外周血CECs水平顯著高于健康新生兒，且CECs水平隨缺氧程度的加重而顯著增加，表明外周血CECs增多可作為血管內皮損傷的重要病理學特征。本研究結果提示，新生兒外周血CECs檢測可能作為低氧血癥的早期診斷指標，為臨床早期診斷、病情判斷及療效評估提供新的科學依據。

本次研究收集的重度低氧血癥患兒樣本數較少，下一步本課題組將擴大樣本量，針對低氧血癥患兒進行跟蹤隨訪，對CECs與缺氧程度的相關性進行更深入的研究。隨著對CECs研究的逐漸深入，它在內皮損傷的非侵襲性研究及臨床應用方面將會顯現出更大的價值。

［1］ 張偉群.新生兒缺氧缺血性腦病多器官損傷及預后影響因素分析［J］.實用心腦肺血管病雜志，2009，17（2）：89－90.

［2］Ferguson ND，Fan E，Camporota L，et al.The Berlin definition of ARDS：an expanded rationale，justification，and supplementary material［J］.Intensive Care Med，2012，38（10）：1573－1582.

［3］ 周雅娟.川崎病外周血循環內皮細胞水平變化與冠狀動脈損傷關系的探討［D］.沈陽：中國醫科大學，2010：7－8.

［4］ 李宏偉，王春玲，修瑞娟.人循環內皮細胞的分離和鑒定［J］.基礎醫學與臨床，2006，26（6）：640－643.

［5］關鍵，王國干.內皮功能檢測及臨床意義［J］.醫學綜述，2007，13（15）：1197－1199.

［6］Hunting CB，Noort WA，Zwaginga JJ.Circulating endothelial（progenitor）cells reflect the state of the endothelium：vascular injury，repair and neovascularization［J］.Vox Sang，2005，88（1）：1－9.

［7］Segal MS，Bihorac A，Ko?M.Circulating endothelial cells：tea leaves for renal disease［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283（1）：F11－F19.

［8］ 常永超，王清江，劉素琴，等.新生豬缺氧模型中循環內皮細胞觀察［J］.洛陽醫專學報，2001，19（3）：186－187.

［9］ 王春玲，張琦，李俊秋，等.循環內皮細胞的研究及進展［J］.中國醫藥導刊，2009，12（2）：195－196.

Number changes of circulating endothelial cells in neonatal hypoxemia and its clinical significance＊

Long Haifeng1，Liang Xiaoyun1，Gu Xiaoqiong1△，Zhang Zhe1，Zhang Yuan1，Yin Yuping2
（1.Department of Clinical Laboratory，Guangzhou Women and Children′s Medical Center，Guangzhou，Guangdong510623，China；2.Guangzhou Medical College，Guangzhou，Guangdong510182，China）

ObjectiveTo explore changes in circulating endothelial cells（CECs）numbers in neonatal hypoxemia and its clinical significance.MethodsHladovec method was used to measure the quantity of CECs in 40cases of neonatus with different degree of hypoxemia（hypoxemia group），and 20matched healthy newborns were enrolled as control group.ResultsThe numbers of CECs in hypoxemia group were much more than those in control group，and the difference was statistically significant.Meanwhile，there were significant differences in CECs numbers between moderate group and mild group（t＝13.43，P＜0.05），as well as moderate group and severe group（t＝7.698，P＜0.05）.ConclusionThe quantity of circulating ECEs in hypoxic neonatus is correlated with the hypoxic severity，which may be used as early diagnostic indicator for hypoxemia，and could provide new scientific evidences for early diagnosis，illness judgment and curative effect evaluation.

circulating endothelial cells； hypoxemia； neonatus

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.003

A

1673－4130（2015）03－0294－02

2014－09－15）

廣東省自然科學基金項目資助（S2013010012520）。 作者簡介：龍海鋒，男，檢驗技師，主要從事臨床檢驗基礎的研究?！?/p>

，E－mail：guxiaoqiong＠163.com。