PEI與脂質體介導基因轉染的比較研究

曹慧玲，滕鳳猛，汪小蓉，顧萬建，張春兵

（江蘇省中醫院/南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇 南京 210029）

PEI與脂質體介導基因轉染的比較研究

曹慧玲，滕鳳猛，汪小蓉，顧萬建，張春兵

（江蘇省中醫院/南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇 南京 210029）

目的比較新型轉染試劑陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）與脂質體2000介導的血管內皮細胞生長因子VEGF165基因轉染人胚腎細胞293T的轉染效率，為基因轉染提供新的方法。方法分別采用脂質體和不同N/P比值的PEI將合成的含有綠色熒光蛋白（GFP）和VEGF165的質粒轉入293T細胞。轉染24h后，采用CCK－8試劑盒檢測細胞活性；轉染48h后在熒光顯微鏡下觀察比較兩種轉染方法的轉染效率，并通過ELISA方法檢測細胞上清液中VEGF165濃度，比較兩種方法的轉染效果。結果當N/P＝9時，PEI轉染的細胞活性與脂質體轉染相近，對細胞的毒性較小；此時，PEI轉染效率與脂質體也相似，均可達到約70%；同樣，轉染后細胞上清中VEGF165濃度較未轉染組提高（P＜0.05），但兩種方法轉染組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論PEI作為一種新型的轉染試劑，與脂質體相比，在一定比例范圍內，具有轉染效率高，對細胞毒性小且價格低廉的優勢，有望成為基因轉染的有效載體。

聚乙烯亞胺； 脂質體； 基因轉染； 轉染效率

基因轉染需要一定的轉染試劑將帶有目的基因的載體運送至細胞內。目前，應用最廣泛的轉染試劑是陽離子脂質體和陽離子聚合物，它們容易通過細胞膜，在通過細胞屏障方面跟病毒有很相似的特征。陽離子脂質體在體外基因轉染中有很高的效率，應用也最為廣泛。然而在體內，它會被迅速清除，并在肺組織內累積，誘發強烈的抗炎反應，具有毒性，這使其應用受到限制。由于陽離子脂質體使用的局限性，陽離子聚合物轉染試劑日益受到關注，聚乙烯亞胺（PEI）就是這樣一類轉染試劑［1］。PEI中的N元素與質粒DNA中P元素的摩爾數的比值（N/P比值）是影響PEI轉染效率的重要因素。本研究旨在觀察不同N/P比值PEI的轉染效率及其對細胞活性的影響并與脂質體轉染試劑進行比較，從而為擴大其應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 293T細胞由南京醫科大學惠贈。PEI分支型，相對分子質量為25×103，為Sigma公司產品；脂質體2000為Invitrogen公司產品；VEGF165質粒［攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因］，由本實驗室構建，見圖1；CCK－8試劑盒為日本同仁公司生產；高糖DMEM培養液為Hyclone公司生產；胎牛血清為Hyclone公司生產；胰蛋白酶為Sigma公司生產；VEGF165 ELISA試劑盒為R＆D公司生產；PBS緩沖液購自南京天為公司。

1.2 方法

1.2.1 脂質體轉染混合液配制 取無血清DMEM 100μL，加入質粒DNA 8μg，室溫放置5min，取10μL脂質體2000加入無血清DMEM 100μL，放置5min，將二者混合后放置20 min，備用。

1.2.2 PEI轉染混合液配制 取無血清DMEM 100μL，加入質粒DNA 8μg，放置5min，另根據不同N/P比值將PEI稀釋至不同質量濃度，加入無血清DMEM 100μL中，放置5min，將兩者混合，邊加入邊震蕩，混合后放置20min，備用。

1.2.3 N/P比值的優化 本實驗所用DNA質量為8μg，根據公式：N/P＝PEI（μg）/DNA（μg）×7.75進行計算，所需PEI的質量見表1。

1.2.4 細胞培養 293T細胞培養于DMEM［含10%胎牛血清（FBS）中］，置于37℃、5%CO2條件下連續培養，轉染前24 h將細胞接種于6孔板中，每孔5×105個細胞且均勻分布，用于轉染。

1.2.5 293T細胞轉染 取6孔板細胞，PBS緩沖液洗滌兩次，轉染組細胞分別加入脂質體轉染混合液和PEI轉染混合液，對照組加入等量無血清DMEM，邊加邊混勻，37℃，5% CO2培養6h。轉染后去除轉染混合液，每孔加入完全培養基2mL繼續培養，48h后檢測轉染效果。

1.2.6 細胞活性檢測 采用CCK－8試劑盒進行檢測。取轉染48h的細胞接種于96孔板，培養過夜后，每孔加入CCK－8檢測試劑10μL，37℃孵育4h，酶標儀檢測吸光度（A）值。

1.2.7 轉染后綠色熒光觀察 在熒光顯微鏡下觀察轉染48h后帶有綠色熒光的細胞比例，有綠色熒光說明轉染成功。

1.2.8 ELISA檢測培養上清VEGF165 取轉染48h后細胞培養上清，按照VEGF165ELISA試劑盒說明書操作，得到培養上清中VEGF165的濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞活性檢測 PEI轉染組細胞活性隨N/P比值的升高而降低，N/P＝9時接近脂質體轉染組，而所有轉染組細胞較未轉染組細胞活性均有所降低，但除N/P＝11時外，其他N/P比值的PEI轉染與脂質體轉染的差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 細胞轉染效率 熒光顯微鏡觀察到未轉染組未見綠色熒光蛋白表達（轉染率為0%），脂質體轉染組可見大部分細胞表達綠色熒光蛋白（轉染率約為70%），PEI轉染組也可見大量細胞表達GFP（轉染率約為75%），可見兩種轉染試劑均能達到較高的轉染效率，見附圖1（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

2.3 細胞上清液VEGF165的濃度 轉染48h后，ELISA法檢測細胞上清液中VEGF165的濃度，見表3。VEGF165的濃度隨N/P比值的增高而增加，當N/P＝9時，PEI轉染結果與脂質體相似，較未轉染組有明顯升高（P＜0.01）。

表2 各組的細胞活性檢測結果（pg/mL，）

＊：P＜0.05，與脂質體轉染組比較；－：無數據。

檢測結果PEI轉染組分組－N/P＝0 3.28±0.34 N/P＝1 3.21±0.32 N/P＝3 3.15±0.27 N/P＝5 3.01±0.28 N/P＝7 2.93±0.22 N/P＝9 2.87±0.25 N/P＝11 2.24±0.30＊脂質體轉染組 2.89±0.28未轉染組3.29±0.36

）表3 細胞上清液中VEGF165的檢測（pg/mL，

－：無數據。

分組 VEGF165水平PEI轉染組 －N/P＝0 5.8±0.46 N/P＝1 9.2±0.11 N/P＝3 23.7±2.34 N/P＝5 67.9±5.53 N/P＝7 147.1±8.24 N/P＝9 241.5±14.76 N/P＝11 235.0±17.55脂質體轉染組 240.3±16.65未轉染組6.1±0.54

3 討 論

PEI是人工合成的含有極高密度正電荷的有機大分子陽離子聚合物。PEI與DNA通過正負電荷的相互吸引形成復合物［2］，是較為有效的聚陽離子型基因載體，轉染效率高，常輔助超聲等物理方法攜帶外源基因進入目的細胞［3－4］。然而，隨著PEI用量的增大，其細胞毒性也隨之升高。同樣，應用最多的脂質體轉染方法與PEI轉染有著相似的特性。但脂質體往往價格較高，相比較而言，PEI價格較低，在適當的比例下，也可發揮較好的轉染效果［5］。

胡偉等［6］比較了PEI與陽離子脂質體轉染人舌鱗癌細胞的轉染效率和細胞毒性，研究發現在各自最佳轉染條件下，PEI轉染效率更高，細胞毒性小。為了進一步了解PEI作為新型轉染試劑的優勢，本研究以293T作為轉染細胞，通過觀察質粒載體上GFP和VEGF165的表達情況，比較了脂質體、PEI兩種轉染試劑的轉染效率。細胞活性檢測結果顯示，較未轉染細胞的細胞活性而言，經過轉染的細胞活性均有所降低，且隨著N/P比值的增加PEI對細胞的毒性也逐漸加大。但是當PEI控制在一定范圍內，與未轉染組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。同時，研究表明當PEI濃度為N/P＝9時，對細胞活性的影響與脂質體轉染方法接近，說明在一定比例范圍內，PEI毒性對細胞活性的影響不大。熒光顯微鏡觀察細胞轉染結果顯示，兩種轉染方法的轉染效率均達到70%（產生綠色熒光的細胞即轉染陽性細胞占總細胞的比例），與脂質體相比，一定N/P比值的PEI轉染同樣具有較好轉染效果。攜帶VEGF165基因的質粒轉染入293T細胞，培養后轉染細胞可表達VEGF165相應蛋白，并分泌入細胞上清中，使得細胞上清中VEGF165的含量增加，增加程度與熒光結果相一致。本研究顯示，加入適當N/P比值的PEI后，兩種方法轉染后細胞上清液中的VEGF165水平與未轉染組比較，均顯著提高，再次驗證了PEI與脂質體轉染具有較高的轉染效率，且轉染效果相似。

目前，PEI及其相關復合試劑廣泛應用于醫學的各個領域［7］，Liang等［8］認為PEI與普流尼克通過表面交聯可以達到更好的轉染效果；Shao等［9］學者則利用PEI包裹病毒樣顆粒介導isRNA用于治療乳腺癌研究；Liu等［10］利用PEI－PEG將DNA及藥物特異性導入腫瘤細胞；傅曉源等［11］制備了PEI載基因納米顆粒并研究其理化性質及體外活性。本文的研究也提示，在適合的比例下PEI可以替代脂質體，作為新型有效的轉染試劑用于實驗研究中。

PEI作為新型轉染試劑，其細胞毒性一定程度上制約了其的應用，因此，有更多的研究者提出對PEI的加入量加以控制（N/P比值）或對其進行重新構建，以減少其對細胞活性的影響［12］。

綜上所述，通過比較陽性聚合物PEI與脂質體2000兩種轉染試劑分別介導VEGF165質粒的轉染效率，說明PEI在適當的N/P比值時，可以達到與脂質體同樣或更好的轉染效果，如將PEI加以改造，構建新的復合轉染試劑，可有效降低PEI的生物毒性，使其應用更為廣泛。由于PEI較脂質體而言具有轉染效率高且經濟實惠的優勢，提示其可作為新型的轉染試劑廣泛應用于醫療領域。

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［11］傅曉源，張浩偉，謝灝，等.聚乙烯亞胺載基因納米顆粒的制備及其相關特性的研究［J］.中國現代醫學雜志，2008，18（24）：3570－3572.

［12］Huang X，Hartley AV，Yin Y，et al.AAV2production with optimized N/P ratio and PEI－mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications［J］.J Virol Methods，2013，193（2）：270－277.

Comparison of gene transfection reagents between PEI and lipofectamine

Cao Huiling，Teng Fengmeng，Wang Xiaorong，Gu Wanjian，Zhang Chunbing
（Department of Clinical Laboratory，Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine/Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu210029，China）

ObjectiveTo compare the transfection efficiency of cationic polyethylenimine（PEI）with Lipofectamine 2000TM by using the plasmid DNA encoding vascular endothelial cell growth factor（VEGF165）gene in human embryonic kidney cell line 293T.MethodsPEI of different N/P ratio and Lipofectamine 2000TM were used to deliver the vector containing VEGF165to 293Tcells，respectively.Green fluorescent protein（GFP）gene was inserted into the vector as a report gene.Evaluation of cytoactive was performed by CCK－8assay 24hafter transfection.The cells were observed by fluorescent microscope and the presence of VEGF165in cell supernatant was detected by ELISA 48hafter transfection.The transfection efficiency was calculated and compared.ResultsSimilar cytoactive and best transfection efficiency could be obtained when N/P ratio was 9，the transfection efficiency was around 70%.Furthermore，the presence of VEGF165increased significantly after transfection（P＜0.05），but there was no significant difference between the two groups in which different transfection methods were adopted.ConclusionPEI as a novel oligofectamine reagent could mediate more efficient transfection compared with lipofectamine.It also has low cell－toxicity and low price and could be an ideal vector in gene delivery technology.

polyethylenimine； lipofectamine； gene transfection； transfection efficiency

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.018

A

1673－4130（2015）03－0328－03

2014－12－08）

曹慧玲，女，主管檢驗技師，主要從事醫學檢驗基礎研究。