252例結直腸癌患者胸苷酸合成酶基因多態性分析

金曉波，彭南求（.寧波市明州醫院，浙江 寧波 3504；2.上海賽安生物醫藥科技有限公司，衛生部醫藥衛生科技發展研究中心腫瘤個體化治療分子診斷技術研究基地，上海 20900）

252例結直腸癌患者胸苷酸合成酶基因多態性分析

金曉波1，彭南求2△
（1.寧波市明州醫院，浙江 寧波 315104；2.上海賽安生物醫藥科技有限公司，衛生部醫藥衛生科技發展研究中心腫瘤個體化治療分子診斷技術研究基地，上海 201900）

目的分析結直腸癌患者腦苷酸合成酶（TS）基因多態性，以期能為結直腸癌的個體化治療提供指導。方法采用PCR測序的方法分析252例結直腸癌患者TS基因多態性。結果共檢測了252例結直腸癌患者，其中男137例、女115例。男性患者TS基因型主要為3RG/3RC（36.50%），其次是2RC/3RC和3RG/3RG（各占18.25%）。女性患者基因型也主要是3RG/3RC（36.52%），其次是3RG/3RG（26.09%）。28例年輕患者中，基因型主要為3RG/3RC（42.86%），其次是2RC/3RG（21.43%）；84例中年患者中，基因型主要為3RG/3RC（45.24%），其次是2RC/3RC（16.67%）；115例老年患者中，基因型主要為3RG/3RC（36.52%），其次是2RC/3RG（16.52%）。結論結直腸癌患者TS基因多態性檢測中發現的主要基因型為3RG/3RC。

結直腸癌； 胸苷酸合成酶； 基因多態性

結直腸癌是常見的高危害消化道惡性腫瘤，發生率僅次于胃癌和食道癌。全球每年新發病例超過100萬，年死亡數超過50萬。中國每年新發病例已超過17萬，死亡近10萬。近二十年來結直腸癌的發病率在逐漸增加，同時，其發病年齡正趨向老齡化。一般而言，結直腸癌多在60～70歲發病，50歲以下的患者所占比例不到20%。中國患者的發病年齡多在40～60歲，中位發病年齡比歐美約提前10年，高峰在50歲左右，但30歲以下的結直腸癌患者也比歐美多見［1－3］。胸苷酸合成酶（TS）參與DNA的合成，5－氟尿嘧啶（5－FU）主要通過抑制TS而發揮抗腫瘤的作用。TS基因多態性造成TS蛋白表達和功能的差異，影響5－FU化療有效性。TS基因啟動增強子區5′端的一個28bp的序列可發生2～3次的重復（2R/3R）多態性，影響TS基因的轉錄水平。3R將導致TS基因表達增加，TS活性提高。2R純合子和2R/3R雜合子有臨床生存期的顯著提高，而3R純合子無生存獲益［4］。在3R/3R情況下，如果第二個重復中的第12個堿基同時存在G＞C的多態性，將使TS表達量降低至2R水平［5］，5－FU的療效較好［6］。本研究采用PCR－測序法研究了252例中國人結直腸癌腫瘤血液標本中TS的基因多態性，同時比較了不同性別和年齡群體中TS基因突變頻率的差異，以期能為5－氟尿嘧啶的使用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 標本來源 本研究使用的臨床樣本來自全國上百家三級醫院，包括252例血液標本。所有參與本研究的結直腸癌患者或其家屬均簽署過授權給上海賽安生物醫藥科技有限公司進行TS基因檢測的知情許可同意書。所有標本均為抽取2mL外周血，置于EDTA抗凝管中，低溫保存和運輸。

1.2 儀器與試劑 實驗使用的Pfu酶、dNTP購自上海申能博彩生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自Axygen Scientific公司，所使用的PCR儀則購自杭州博日科技有限公司，離心機購自湘儀離心機儀器有限公司，PCR產物序列測定由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.3 方法 基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行。TS基因多態性檢測采用PCR測序法，用primer5軟件進行引物設計，由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。檢測步驟為：（1）PCR擴增，正向引物：GTG GCT CCT GCG TTT CCC CC，反向引物：GCT CCG AGC CGG CCA CAG GCA TGG CGC GG，擴增產物片段大小為242bp。25L擴增體系包括2.5L10× PCR緩沖液0.4mol/L的上、下游引物，0.25mmol/L的dNTP，0.5UPfu酶，100ng DNA模板。PCR擴增程序為95℃先變性3min，然后進行45個循環的擴增：95℃40s，58℃20s，70℃40s，最后在72℃延伸5min。（2）PCR產物純化測序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

2 結 果

2.1 PCR產物測序結果 采用PCR的方法，檢測TS基因多態性，其代表性結果見附圖1（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

2.2 結直腸癌患者TS基因型分布 本研究共檢測了252例結直腸癌患者，其中男137例、女115例。男性患者TS基因型主要為3RG/3RC，占36.50%，其次是2RC/3RC和3RG/3RG，各占18.25%；女性患者基因型也主要是3RG/3RC，占36.52%，其次是3RG/3RG，占26.09%；28例年輕患者中，基因型主要為3RG/3RC，占42.86%，其次是2RC/3RG，占21.43%；84例中年患者中，基因型主要為3RG/3RC，占45.24%，其次是2RC/3RC，占16.67%；115例老年患者中，基因型主要為3RG/3RC，占36.52%，其次是2RC/3RG，占16.52%。2RC/2RG是一種罕見的基因型，252例患者中僅在女性老年患者中發現1例。見表1。

3 討 論

TS催化dUMP轉變成dTMP，它是胸苷酸唯一的從頭合成途徑［7］。TS＊3R基因多態性在不同種族中的分布頻率存在差異，肯尼亞人是49%，高加索人是55%，中國人是82%［8］，土耳其人是58%［9］。有文獻報道了在3′UTR發現了另外一個多態性TS 1494del6位點［10］，這個多態性在美國白人中的分布頻率是71%，在中國華北和華南的分布頻率分別是32.0%和30.9%［11］。基因多態性存在種族差異，可能是由于遺傳和生存環境的不同造成的。最新的研究表明，相比較于3R基因型，2R基因型個體更容易罹患結直腸癌，而TS 1494del6則沒有影響［12］。Zhou等［13］的Meta分析也支持這一個觀點，2R/2R基因型的亞洲人更容易罹患癌癥，而對于高加索人來講，這種基因型反而有保護作用。有研究發現，TS 1494del6會導致TS mRNA表達水平的減少，這個多態性可能和mRNA的穩定性和翻譯有關［14－15］，攜帶ins 6bp/ins 6bp基因型患者TS mRNA表達水平是純合刪除基因型（del 6bp/del 6bp）的4倍，而雜合基因型（del 6bp/ins 6bp）則位于中間。

Thomas等［16］在高加索人TS的第一個重復中發現了一個稀有的單核苷酸多態性（SNP），這個SNP在非裔美國人亞洲人中都沒有被發現，它和TS的關系需要更多的研究來證明。他們還在3RC等位基因中發現了6bp的插入，在高加索人和非裔美國人中的頻率分別是0.4%和1.3%，這個多態性最早是在日本人中發現的，出現頻率是0.6%［17］，至于6bp的插入對TS功能的影響目前還不清楚。

TS是廣泛使用的化療藥5－FU的靶點。5－FU治療的致死率是0.5%，引發3－4級毒性副反應的概率是20%～30%［18－22］。對這個藥物相關的一些基因如TS多態性進行分析被認為可以有效地預測不良反應和治療結果，Lecomte等［23］研究發現，2R/2R、2R/3R、3R/3R基因型患者發生3～4級毒性反應的概率分別是43%、18%、3%，單倍型2R/ins 6bp患者有嚴重的不良反應。因此，TS基因型有可能可以作為基于5－FU化療不良反應預測的指標，從而指導醫生個體化用藥。也有研究認為TS的基因多態性并不能預測5－FU治療Ⅲ期結腸癌的療效，然而，年齡會影響TS的基因多態性對生存的作用［24］。

葉酸是一個重要的微量營養素分子，參與DNA的合成、甲基化和修復。TS不僅在DNA復制和修復中提供需要的核苷酸方面發揮重要的作用，而且在葉酸代謝中也起著很重要的作用［8，10，25］。Trinh等［26］研究發現，TS 3R/3R基因型和血漿葉酸減少相關，而低葉酸水平則會增加罹患結直腸癌的風險［27－28］。

［1］Zhao P，Dai M，Chen W，et al.Cancer trends in China［J］.Jpn J Clin Oncol，2010，40（4）：281－285.

［2］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009［J］.CA Cancer J Clin，2009，59（4）：225－249.

［3］楊玲，李連弟，陳育德，等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發病死亡的估計與預測［J］.中國衛生統計，2005，22（4）：218－221.

［4］Villafranca E，Okruzhnov Y，Dominguez MA，et al.Polymorphisms of the repeated sequences in the enhancer region of the thymidylate synthase gene promoter May predict downstaging after preoperative chemoradiation in rectal Cancer［J］.J Clin Oncol，2001，19（6）：1779－1786.

［5］Toffoli G，Cecchin E.Pharmacogenomics and stomach cancer［J］.Pharmacogenomics，2004，5（6）：627－641.

［6］Marcuello E，Altés A，del Rio E，et al.Single nucleotide polymor－orouracil with or without oxaliplatin as first－line treatment in advanced colorectal Cancer［J］.J Clin Oncol，2000，18（16）：2938－2947.

［19］de Gramont A，Bosset JF，Milan C，et al.Randomized trial comparing monthly low－dose leucovorin and fluorouracil bolus with bimonthly high－dose leucovorin and fluorouracil bolus plus continuous infusion for advanced colorectal Cancer：a French intergroup study［J］.J Clin Oncol，1997，15（2）：808－815.

［20］Douillard JY，Cunningham D，Roth AD，et al.Irinotecan combined with fluorouracil compared with fluorouracil alone as first－line treatment for metastatic colorectal Cancer：a multicentre randomised trial［J］.Lancet，2000，355（929）：1041－1047.

［21］Gamelin EC，Danquechin－Dorval EM，Dumesnil YF，et al.Relationship between 5－fluorouracil（5－FU）dose intensity and therapeutic response in patients with advanced colorectal Cancer receiving infusional therapy containing 5－FU［J］.Cancer，1996，77（3）：441－451.

［22］van Kuilenburg AB，Meinsma R，van Gennip AH.Pyrimidine degradation defects and severe 5－fluorouracil toxicity［J］.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，2004，23（8/9）：1371－1375.

［23］Lecomte T，Ferraz JM，ZinzindohouéF，et al.Thymidylate synthase gene polymorphism predicts toxicity in colorectal Cancer patients receiving 5－fluorouracil－based chemotherapy［J］.Clin Cancer Res，2004，10（17）：5880－5888.

［24］Faria－Sarasqueta A，Gosens MJ，Moerland E，et al.TS gene polymorphisms are not good markers of response to 5－FU therapy in stageⅢcolon cancer patients［J］.Anal Cell Pathol，2010，33（1）：1－11.

［25］Horie N，Aiba H，Oguro K，et al.Functional analysis and DNA polymorphism of the tandemly repeated sequences in the 5′－terminal regulatory region of the human gene for thymidylate synthase［J］.Cell Struct Funct，1995，20（3）：191－197.

［26］Trinh BN，Ong CN，Coetzee GA，et al.Thymidylate synthase：a novel genetic determinant of plasma homocysteine and folate levels［J］.Hum Genet，2002，111（3）：299－302.

［27］Giovannucci E，Rimm EB，Ascherio A，et al.Alcohol，low－methionine－－low－folate diets，and risk of colon Cancer in men［J］.J Natl Cancer Inst，1995，87（4）：265－273.

［28］Kato I，Dnistrian AM，Schwartz M，et al.Serum folate，homocysteine and colorectal Cancer risk in women：a nested case－control study［J］.Br J Cancer，1999，79（11/12）：1917－1922.phism in the 5′tandem repeat sequences of thymidylate synthase gene predicts for response to fluorouracil－based chemotherapy in advanced colorectal Cancer patients［J］.Int J Cancer，2004，112（5）：733－737.

［7］Rustum YM，Harstrick A，Cao S，et al.Thymidylate synthase inhibitors in Cancer therapy：direct and indirect inhibitors［J］.J Clin Oncol，1997，15（1）：389－400.

［8］Marsh S，Collie－Duguid ES，Li T，et al.Ethnic variation in the thymidylate synthase enhancer region polymorphism among Caucasian and Asian populations［J］.Genomics，1999，58（3）：310－312.

［9］Süzen HS，Yüce N，Güven G，et al.TYMS and DPYD polymorphisms in a Turkish population［J］.Eur J Clin Pharmacol，2005，61（12）：881－885.

［10］Ulrich CM，Bigler J，Velicer CM，et al.Searching expressed sequence tag databases：discovery and confirmation of a common polymorphism in the thymidylate synthase gene［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2000，9（12）：1381－1385.

［11］Zhai X，Gao J，Hu Z，et al.Polymorphisms in thymidylate synthase gene and susceptibility to breast Cancer in a Chinese population：a case－control analysis［J］.BMC Cancer，2006，6（1）：138.

［12］Gao CM，Ding JH，Li SP，et al.Polymorphisms in the thymidylate synthase gene and risk of colorectal Cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（8）：4087－4091.

［13］Zhou JY，Shi R，Yu HL，et al.The association between two polymorphisms in the TS gene and risk of Cancer：a systematic review and pooled analysis［J］.Int J Cancer，2012，131（9）：2103－2116.

［14］Lenz HJ，Zhang W，Zhahedy S，et al.A 6base－pair deletion in the 3′UTR of the thymidylate synthase（TS）gene predicts TS mRNA expression in colorectal tumors［J］.Proc Am Assoc Cancer Res，2002，43（6）：660.

［15］Mandola MV，Stoehlmacher J，Zhang W，et al.A 6bp polymorphism in the thymidylate synthase gene causes message instability and is associated with decreased intratumoral TS mRNA levels［J］.Pharmacogenetics，2004，14（5）：319－327.

［16］Thomas F，Hoskins JM，Dvorak A，et al.Detection of the G＞C SNP and rare mutations in the 28－bp repeat of TYMS using gelbased capillary electrophoresis［J］.Pharmacogenomics，2010，11（12）：1751－1756.

［17］Kim SR，Ozawa S，Saito Y，et al.Fourteen novel genetic variations and haplotype structures of the TYMS gene encoding human thymidylate synthase（TS）［J］.Drug Metab Pharmacokinet，2006，21（6）：509－516.

［18］de Gramont A，Figer A，Seymour M，et al.Leucovorin and flu－

Polymorphism analysis of thymidylate synthase in 252 colorectal cancer patients

Jin Xiaobo1，Peng Nanqiu2△
（1.Ningbo Mingzhou Hospital，Ningbo，Zhejiang315104，China；2.Shanghai Shines Pharmaceuticals Company Limited/Research Base of Molecular Diagnosis Technology for Tumor Personalized Therapy，Development Center for Medical Science and Technology，Ministry of Health，Shanghai 201900，China）

ObjectiveTo analyze the polymorphism of thymidylate synthase（TS）in colorectal cancer patients，further more，to provide guidance for personalized therapy of colorectal cancer.MethodsPCR direct sequencing was used to detect the polymorphism of TS in 252patients with colorectal cancer.ResultsTS genotypes of 252patients with colorectal cancer were detected totally，including 137male and 115female.3RG/3RC accounted for the largest proportion in both male and female（36.50%and 36.52% respectively）.In female，2RC/3RC and 3RG/3RG both accounted for the second largest proportion（both 18.25%）.While in female，3RG/3RC accounted for the second largest proportion（26.09%）.If patients were divided according to age groups，in youth patients（n＝28），3RG/3RC accounted for the largest proportion（42.86%），and the second was 2RC/3RG（21.43%）.In the middle aged patients（n＝84），3RG/3RC（45.24%）and 2RC/3RC（16.67%）were the major genotypes.For old patients（n＝115），the major genotypes were 3RG/3RC（36.52%）and 2RC/3RG（16.52%）.ConclusionThe polymorphism of TS are mainly 3RG/3RC in colorectal cancer patients.

colorectal cancer； thymidylate synthase； polymorphism

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.026

A

1673－4130（2015）03－0347－03

2014－11－08）

金曉波，男，檢驗技師，主要從事分子診斷學的相關研究?！?/p>

，E－mail：nqpeng＠163.com。