應用16SrRNA熒光定量PCR技術研究β－內酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群的影響

賀 銳，張 翀，章國平，趙翠生

（甘肅省婦幼保健醫院檢驗科，蘭州 730050）

應用16SrRNA熒光定量PCR技術研究β－內酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群的影響

賀 銳，張 翀，章國平，趙翠生△

（甘肅省婦幼保健醫院檢驗科，蘭州 730050）

目的探討β－內酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群的影響。方法選取0～1歲嬰兒，應用16SrRNA熒光定量PCR技術，分別測定β－內酰胺類抗菌藥物使用前，使用第3d、5天時，及治愈后第7天糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、大腸桿菌的水平。結果使用過β－內酰胺類抗菌藥物者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌的數量與未使用者比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌含量隨治療時間的延長而增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。未使用抗菌藥物的患兒腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的恢復明顯快于使用過抗菌藥物的患兒，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論β－內酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群有普遍的殺滅作用，對嬰兒腸道菌群改變的影響是輕微的。β－內酰胺類抗菌藥物的使用會延遲患兒腸道微生態的恢復，但若合理使用對疾病的治療有積極作用。

腸道菌群； 抗菌藥物； 16SrRNA； 嬰兒

腸道菌群是人體重要的微生態系統之一，直接參與人體的消化、營養吸收、能量供應、脂肪代謝、免疫調節等多種生理功能，相當于人體的一個重要“器官”［1］。嬰兒時期，腸道微生態環境初步建立，對代謝、免疫系統的發育和成熟等起著十分重要的作用［2］。β－內酰胺類抗菌藥物的使用對嬰兒腸道菌群的影響一直以來備受關注。本研究采用病例對照研究，運用細菌涂片、細菌培養、16SrRNA熒光定量PCR分析等檢測手段，對β－內酰胺類抗菌藥物的使用對嬰兒腸道菌群的影響進行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年7月至2013年3月于本院就診的嬰兒作為研究對象。健康嬰兒組：4周內未使用過β－內酰胺類抗菌藥物、微生態制劑且無胃腸道癥狀，健康體檢合格的0～1歲嬰兒，共50例。對照組：未使用抗菌藥物，以支持治療為主的0～1歲嬰兒。研究組：合并細菌感染性疾病，以β－內酰胺類抗菌藥物治療為主的0～1歲嬰兒。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集與處理 對照組取入院第3、5天及愈后第7天糞便標本各10g，研究組留取使用抗菌藥物前，使用抗菌藥物第3、5天和愈后第7天的糞便標本各10g。標本置無菌杯內立即送檢，進行培養、接種、涂片，剩余標本用無菌干燥管儲存，－80℃冰箱保存備用。

1.2.2 腸道細菌DNA的提取 取凍存的糞便標本復融，每l g加1mL的PBS（0.05mol/L，pH7.4）充分顛倒混勻5～10 min，然后低速離心（2 000r/min）5min，取上清，上述過程重復3次，收集上清高速離心（13 000r/min）3min后取沉渣，沉淀物用PBS液洗4次，水洗1次，后加50μL蒸溜水懸浮，50μL 1%TritonX－100破碎菌體，100℃煮沸5min立即放人冰水中冷卻［3］。

1.2.3 PCR引物 對所選用引物序列分別與4種細菌的16S rRNA全序列在BLAST數據庫進行比較驗證，4種細菌上、下游引物如下：雙歧桿菌CTC CTG GAA ACG GGT GG［4］，GGT GTT CTT CCC GAT ATC TAC A，擴增片段為550bp；乳酸桿菌AGC AGT AGG GAA TCT TCC A，ATT TCA CCG CTA CAC ATG［5］，擴增片段為380bp；腸球菌TCC ACG CCG TAA ACG ATG AG，GAC ACG AGC TGA CGA CAA CC，擴增片段274bp［6］；大腸埃希菌GGA GCA AAC AGG ATT AGA TAC CC，CCC AAC ATT TCA CAA CAC G［7］，擴增片段317bp。

1.2.4 熒光定量PCR反應體系 采用25μL反應體系，包括10×Buffer 2.5μL，4×dNTP（0.25mmol/L）2μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，上下游引物（0.25μmol/L）各0.25μL，Taq酶（1U/μL）0.75μL，DNA模板3μL，熒光染料SYBR green 2.5μL，雙蒸水11.25μL。應用Mx3000P型熒光定量PCR儀進行擴增與分析。

1.2.5 PCR反應條件 95℃變性5min；95℃15s，60℃1 min，72℃45s，87℃5s共40個循環；72℃延伸10min后結束。60～95℃作熔解曲線，各細菌的熔解曲線見附圖1～4（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）

1.2.6 標準曲線制作 分別純化上述PCR反應過程中得到的4種細菌PCR產物，具體步驟如下：在DNA溶液中加入1/10體積3mol/L pH 5.2的乙酸鈉，在旋渦混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻，加入2～2.5倍體積的無水乙醇，振蕩混勻并置于冰上30min，離心5min棄上清，加入1mL 70%的乙醇，顛倒混勻離心棄上清，干燥沉淀。將干燥沉淀物溶于適當體積的無菌水或TE緩沖液即成。在分光光度儀上測定4種細菌純化產物的吸光度值。參照1個吸光度值雙鏈DNA片段（1kb）相當于4.74×1013copies/mL的標準，計算出每毫升PCR產物中所含的拷貝數，然后做10倍系列稀釋，使其形成104～108copies/mL的系列濃度的溶液，按上述條件進行熒光定量PCR，形成標準曲線。

1.2.7 細菌產物的驗證 通過對4種細菌標準菌株做熒光定量PCR，利用熔解曲線比較產物解鏈溫度（TM）與標準菌株TM值的差異，經驗證，腸道菌群PCR擴增產物為雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌的特異性產物，

1.2.8 檢測靈敏度分析 通過對上述4種細菌標準菌株菌落做系列稀釋（102～108cfu/mL）后行熒光定量PCR，證明100 cfu/mL細菌的檢測標本仍能呈現特征性熔解曲線，說明用上述引物通過熒光定量PCR檢測上述4種細菌有較好的檢測靈敏度。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0軟件對數據進行處理，對PCR定量檢測數據進行對數處理后（log copies/g）以表示，組間兩兩比較采用t檢驗，三組及以上計量資料的比較采用方差分析，若P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

研究組糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌水平都較對照組患兒略低，但差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。分析嬰兒腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌在使用β－內酰胺類抗菌藥物治療不同時期糞便中含量的變化，隨治療時間的延長，雙歧桿菌、乳酸桿菌逐步增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。采用成組t檢驗比較研究組與對照組愈后一周腸道微生態的恢復情況，見表3，對照組患兒腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的恢復明顯快于研究組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。健康嬰兒糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌的水平見表4。

3 討 論

β－內酰胺類抗菌藥物在控制嬰幼兒感染性疾病中起著舉足輕重的作用，由于耐藥菌株的不斷產生，臨床β－內酰胺類抗菌藥物應用日益廣譜化、高檔化。廣譜抗菌藥物大量應用導致醫源性菌群失調的問題也日益凸顯［8－9］，尤其是β－內酰胺類抗菌藥物在嬰幼兒疾病中的使用。

腸道微生態是由腸道菌群在腸道內形成的一個龐大而復雜的系統，由自身的專性厭氧菌和部分外籍菌及環境菌群構成［10］。在局部環境改變、機體免疫力下降、或廣譜抗菌藥物使用等條件下，正常菌群發生數量或性質的異常變化，以數量的變化為主，即腸道菌群比例失調［11］。而本研究顯示，抗菌藥物對腸道菌群有普遍的殺滅作用，但對合并細菌感染性疾病的嬰兒腸道菌群改變的影響是有限的。感染性腹瀉患兒因感染導致腸道生物屏障的破壞，抵抗細菌腸道定植的能力減弱，腸道正常的菌群結構被擾亂。合理的使用β－內酰胺類抗菌藥物在治療感染的同時可以使臨床癥狀得到緩解，讓腸道環境逐步改善。本研究顯示，合并細菌感染性疾病的患兒治愈后7天腸道中益生菌的數量已經與健康嬰兒已基本接近。同時，未使用β－內酰胺類抗菌藥物的患兒，腸道微生態環境的恢復明顯快于使用了β－內酰胺類抗菌藥物的患兒，這也提示臨床治療中，應積極考慮調整患兒腸道微生態環境，以利于疾病的恢復。

嬰兒疾病治療中廣譜抗菌藥物β－內酰胺類抗菌藥物的使用存在諸多爭議，在治療中應盡可能以病原學和藥敏試驗為基礎，嚴格掌握β－內酰胺類抗菌藥物的應用指標，結合嬰兒腸道微生態特點，及時、合理應用微生態制劑，改善β－內酰胺類抗菌藥物造成的菌群失調，增強宿主適應性，在確保抗感染療效的同時及時糾正腸道微生態失衡對嬰兒的生長發育帶來的不良影響。

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The impact ofβ－lactam antibiotics on infants′intestinal flora detected by using 16S rRNA quantitative PCR technique

He Rui，Zhang Chong，Zhang Guoping，Zhao Cuisheng△
（Department of Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Care Hospital，Lanzhou，Gansu730050，China）

ObjectiveTo investigate the influence ofβ－lactam antimicrobial drugs on infants′intestinal flora.MethodsInfants from 0to 1years old were enrolled in the study，who′s feces samples were tested for Bacillus bifidus，lactobacillus，enterococcus and E.coli by using 16SrRNA quantitative PCR technique before using antibiotics，on the third and fifth day duringβ－lactam antibiotics treatment and the seventh day after treatment.ResultsThe numbers of Bacillus bifidus，lactobacillus，E.coli and enterococci detected in usingβ－lactam antibiotics group were not statistically different from those in not using antibiotics group（P＞0.05）.The numbers of Bacillus bifidus and lactobacillus increased with the treatment process，the differencies was statistically significant（P＜0.05）.The recovery of the numbers of intestinal Bacillus bifidus and lactobacillus in not using antibiotics group was significantly faster than using antibiotics group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusionβ－lactam antibiotics have general killing effect on the intestinal flora in infants，which could recover to normal.The recovery of intestinal flora could be delayed if antibiotics are used，however，reasonable antibiotics treatment would be very helpful in the treatment of primary diseases.

intestinal flora； antibiotics； 16SrRNA； infant

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.030

A

1673－4130（2015）03－0357－03

2014－11－10）

賀銳，女，副主任檢驗師，主要從事微生物及分子生物學的研究。△

，E－mail：zhaocuisheng123＠126.com。