過敏性哮喘患兒血漿IFN－γ與IL－4及糞便雙歧桿菌檢測及分析＊

張 紅，顧 猛

（1.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇 213001；2.常州市兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇 213003）

過敏性哮喘患兒血漿IFN－γ與IL－4及糞便雙歧桿菌檢測及分析＊

張 紅1，顧 猛2△

（1.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇 213001；2.常州市兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇 213003）

目的探討輔助T淋巴細胞（Th）亞群Th1/Th2平衡及腸道正常菌群在兒童過敏性哮喘發(fā)病中的意義，為臨床通過益生菌的早期干預(yù)來糾正Th1/Th2平衡提供理論依據(jù)。方法ELISA檢測165例小兒過敏性哮喘患兒（哮喘組）及同期進行健康體檢且合格的150例兒童（對照組）的血清IFN－γ與IL－4水平，同時，使用實時熒光定量PCR法檢測糞便中雙歧桿菌的數(shù)量。在應(yīng)用雙歧桿菌制劑調(diào)節(jié)腸道菌群6個月后再次檢測上述指標(biāo)，結(jié)合臨床相關(guān)檢查資料，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果哮喘組初入院時血漿IFN－γ低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IL－4的水平高于對照組，糞便中雙歧桿菌數(shù)量少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過6個月的益生菌制劑的調(diào)理，哮喘組血漿IFN－γ水平升高，IL－4水平則下降，糞便中雙歧桿菌的數(shù)量增多，與初入院時比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在兒童哮喘患兒中，腸道菌群的平衡關(guān)系到其免疫是否平衡，兩者相互影響，臨床應(yīng)早期進行干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫平衡。

過敏性哮喘； 雙歧桿菌； 干擾素－γ； 白細胞介素－4

小兒支氣管哮喘是一種由干擾素－γ（IFN－γ）、白細胞介素（IL）－4等多種細胞因子參與，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性咳嗽、喘鳴和呼吸困難，并伴有氣道高反應(yīng)性的可逆的、梗阻性呼吸道疾病，其發(fā)病機制非常復(fù)雜，近年來的研究表明Th1、Th2的失衡是哮喘發(fā)病的重要機制［1－2］。Th1/Th2功能平衡與否與小兒過敏性哮喘的輕重及轉(zhuǎn)歸有著直接的關(guān)系。但檢索文獻甚少發(fā)現(xiàn)有關(guān)調(diào)理機體免疫功能與Th1/Th2功能相關(guān)性的探討。本研究通過檢測過敏性哮喘患兒血漿中IFN－γ與IL－4及同期糞便中雙歧桿菌的數(shù)量，從免疫學(xué)和腸道微環(huán)境平衡的角度來探索Th1/Th2及腸道正常菌群在過敏性哮喘中的發(fā)病機制及臨床價值，為臨床通過益生菌的早期干預(yù)來糾正Th1/Th2平衡提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年6月至2013年11月在本院門診及兒童醫(yī)院門診治療的小兒支氣管哮喘患者165例，年齡1～13歲，平均6.2歲，其中男94例，女71例。除此之外，隨機選取同期幼兒園和小學(xué)生健康體檢兒童150例為對照組，無哮喘病及過敏史，采血前1個月內(nèi)無感染及用藥史。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治療方法 補充益生菌。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理 患兒于初次入院和補充益生菌6個月后留取外周靜脈血標(biāo)本，對照組正常體檢時留取標(biāo)本。所有標(biāo)本留取后離心提取血清，－70℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诹羧⊙簶?biāo)本的同時留取其糞便標(biāo)本（復(fù)診前停止服用益生菌制劑）。

1.3.2 IFN－γ和IL－4測定 采用ELISA法，試劑盒由美國RD公司提供，檢驗程序嚴(yán)格按照說明書進行，為確保檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和可比性，所有樣本各項目所用的試劑均為同一批次和同時檢測。

1.3.3 糞便雙歧桿菌的檢測 實時熒光PCR法檢測糞便中雙歧桿菌的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行資料的輸入和統(tǒng)計分析，雙歧桿菌數(shù)量不呈正態(tài)分布，但取對數(shù)后數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，計量資料以表示，組間比較采用t或t′檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

哮喘組患兒初次入院時及治療6個月后血漿中IFN－γ、IL－4水平、糞便中雙歧桿菌的數(shù)量與對照組比較，IFN－γ水平及雙歧桿菌的數(shù)量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL－4水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。哮喘組患兒補充益生菌治療6個月后血漿IFN－γ、IL－4水平及同期糞便中雙歧桿菌的數(shù)量與初次入院時比較，IFN－γ水平及雙歧桿菌的數(shù)量均有增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL－4水平則下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；基本恢復(fù)到健康兒童水平，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3 討 論

哮喘是主要由Th亞群Th1/Th2細胞比例和功能失衡所引起的免疫反應(yīng)，主要表現(xiàn)為Th2細胞功能亢進，如IL－3、IL－4、IL－5等細胞因子分泌增多，而IFN－γ、IL－2等Th1細胞因子分泌減少，致Th1/Th2比例失衡［3］。IL－4、IL－5等Th2細胞因子增多可導(dǎo)致氣道局部慢性炎癥，產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性而致哮喘。IL－4即B細胞生長因子，主要作用于B細胞，是IgE特異性誘導(dǎo)劑，能增強IgE介導(dǎo)的體液免疫和殺傷細胞的殺傷能力。IL－4作為B細胞的生長和分化因子，參與B細胞增殖及對抗原刺激的應(yīng)答產(chǎn)生抗體的過程，可以促進IgE的合成和釋放，同時它也是氣道高反應(yīng)的必需因子，在氣道變應(yīng)性炎癥形成過程中主要起著使嗜酸性粒細胞募集、趨化和浸潤的作用，并且能夠抑制Th1細胞分泌IFN－γ，在Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，參與變應(yīng)性炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。IFN－γ是一種對細胞功能具有調(diào)節(jié)作用的小分子多肽，由活化的Th1細胞和NK細胞產(chǎn)生，可抑制B細胞產(chǎn)生IgE、IgG1和IgG4，在哮喘發(fā)病中具有至關(guān)重要的作用。而IFN－γ本身也能促進Th0細胞向Th1細胞分化，抑制Th2細胞的分化；IFN－γ抑制氣道黏膜中嗜酸性粒細胞的聚集和活化；IFN－γ是IL－4的拮抗因子，通過抑制IL－4mRNA轉(zhuǎn)錄來抑制B細胞表達低親和IgE受體，從而抑制B細胞增殖及分泌抗體［4］。

哮喘組治療前IFN－γ水平明顯低于對照組，而IL－4水平則明顯高于對照組，且與患兒病情嚴(yán)重程度相關(guān)，病情越重，IFN－γ水平越低。而IL－4水平越高，說明IFN－γ及IL－4在過敏性哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，Th1/Th2失衡與哮喘發(fā)病有關(guān)。這說明以IL－4為代表的Th2類細胞因子參與了Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，促進了IgE的合成和釋放，而以IFN－γ為代表的Th1細胞因子通過對IL－4的拮抗來抑制B細胞分泌抗體。經(jīng)過6個月的治療后，Th1/Th2細胞比例有了很大的改善，而患兒的臨床癥狀也得到較大的改善，從而也進一步證實了哮喘是由Th1/Th2細胞比例和功能失衡所引起的一種免疫反應(yīng)。

腸道作為人體最大的免疫器官，自出生就暴露于大量的微生物抗原和食物抗原之下，在其刺激下，腸黏膜淋巴細胞被激活，達到全身免疫的效果，一旦菌群失調(diào)則可以導(dǎo)致機體體液免疫、細胞免疫以及非特異性免疫功能降低［5－7］。本研究腸道正常菌群對免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，一旦腸道發(fā)生菌群失調(diào)，將導(dǎo)致Th1/Th2細胞比例失衡，機體的免疫力將明顯下降，提示臨床上避免濫用抗菌藥物和重視益生菌的補充。益生菌通過誘導(dǎo)Th0細胞向Th1細胞分化，抑制Th2型免疫反應(yīng)實現(xiàn)對Th1和Th2的調(diào)節(jié)，使宿主的免疫應(yīng)答或免疫耐受達到精細的平衡，從而達到維持宿主健康的最終目的。

綜上所述，過敏性哮喘患兒存在著明顯的免疫失衡問題，IFN－γ與IL－4是一對相互拮抗的細胞因子，兩者均參與了IgE的調(diào)節(jié)，具有協(xié)同作用，從而導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，這可能是導(dǎo)致小兒哮喘的主要原因之一。過敏性哮喘患兒糞便中雙歧桿菌數(shù)量明顯下降，說明患兒存在腸道菌群的紊亂，通過雙歧桿菌制劑的調(diào)理，血漿IFN－γ水平上升，而IL－4水平下降，Th1/Th2比例趨于平衡，說明哮喘發(fā)作時，腸道菌群是否平衡關(guān)系到其免疫是否平衡，兩者相互影響。本研究可以為臨床早期使用益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫平衡，以期達到預(yù)防哮喘的目的，提供理論支撐。

［1］Verhulst SL，Vael C，Beunckens C，et al.A longitudinal analysis on the association between antibiotic use，intestinal microflora，and wheezing during the first year of Life［J］.J Asthma，2008，45（9）：828－832.

［2］ 王華強，張世明，李強.白細胞介素－4和γ－干擾素在哮喘發(fā)病機制中的研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1997，22（1）：59－61.

［3］Fang SP，Tanaka T，Tago F，et al.Immunomodulatory effects of gyokuheifusan on INF－gamma/IL－4（Th1/Th2）balance in ovalbumin（OVA）－induced asthma model mice［J］.Biol Pharm Bull，2005，28（5）：829－833.

［4］肖玲莉，楊毅，周蓮寶，等.益生菌調(diào)節(jié)濕疹患兒Th1/Th2平衡及對腸道菌群的影響［J］.中國兒童保健雜志，2007，15（3）：247－248.

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The determination of plasma IFN－γand IL－4 and fecal bifidobacteria in children with allergic asthma and analysis＊

Zhang Hong1，Gu Meng2△
（1.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changzhou，Jiangsu213001， China；2.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Children′s Hospital，Changzhou，Jiangsu213003，China）

ObjectiveTo explore the pathogenesis and clinical value of Th1/Th2and normal intestinal flora from the angle of immunological and intestinal micro environment balance by detecting the plasma interferon－γ（IFN－γ）and interleukin－4（IL－4）and fecal bifidobacteria in Children with Allergic Asthma，so as to provide a theoretical basis through early intervention of probiotics to correct the Th1/Th2balance.MethodsThe levels of blood plasma IFN－γ，IL－4and fecal bifidobacteria amount of 165cases of children with allergic asthma and 150health students as control group were detected by ELISA and real time fluorescence PCR at the same time.Retesting these above indexes after applying bifidobacteria regulation of intestinal flora for 6months.The clinical relative factors and experimental data were statistically analyzed.ResultsThe level of IFN－γof asthmatic children were remarkably lower than those in the control group（P＜0.05），while the level of IL－4of asthmatic children were remarkably higher than those in the control group（P＜0.05），and the amount of bifidobacteria of asthmatic children were remarkably lower than those in the control group（P＜0.05）.The level of IFN－γand bifidobacteria of asthmatic children improved remarkably and the level of IL－4decreased significantly after applying bifidobacteria regulation of intestinal flora for 6months.All of them had remarkable statistically significant.ConclusionThe immune balance was affected by the intestinal flora balance of vice versa.This would provide an important theoretical support to prevent the occurrence of allergic asthma by the early probiotics regulation of intestinal flora and immune balance.

allergic asthma； bifidobacteria； interferon－γ； interleukin－4

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.034

A

1673－4130（2015）03－0367－03

2014－11－08）

南通市科技基金資助項目（HS2011060）。 作者簡介：張紅，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗基礎(chǔ)的研究。△

，E－mail：932335114＠qq.com。