標本放置溫度和時間對T淋巴細胞活化標志檢測結果的影響

沈天行，宋建新

（1.云縣人們醫院檢驗科，云南 臨滄 675800；2.云南省第一人民醫院檢驗科，云南 昆明 650032）

標本放置溫度和時間對T淋巴細胞活化標志檢測結果的影響

沈天行1，宋建新2△

（1.云縣人們醫院檢驗科，云南 臨滄 675800；2.云南省第一人民醫院檢驗科，云南 昆明 650032）

目的探討標本放置溫度和時間對流式細胞術檢測T淋巴細胞活化標志結果的影響。方法采集健康體檢者血液，EDTA－K2－抗凝，室溫及4℃保存，在不同時間進行CD3＋T淋巴細胞CD69、CD25、HLA－DR檢測。結果EDTA－K2－抗凝血室溫保存標本與新鮮標本相比，CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋細胞百分率在12h開始減低，CD3＋CD69＋到16h明顯減低（P＜0.05），CD3＋CD25放置到20h時明顯減低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細胞表達逐漸增高，到20h時明顯增高（P＜0.05）；4℃放置的標本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋到24h時明顯減低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細胞表達到24h變化差異無統計學意義（P＞0.05）。結論作為T淋巴細胞的活化標志，室溫放置標本檢測CD3＋CD69＋應在12h內完成，CD3＋CD25＋應在16h內檢測，CD3＋HLA－DR＋可在20h內檢測，最好放置4℃保存標本。

T淋巴細胞； 活化標志； 溫度； 時間

CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DA＋T淋巴細胞是一類已活化的免疫細胞，在免疫應答中起著重要的作用［1］。目前應用流式細胞儀檢測T淋巴細胞活化水平已廣泛應用于許多疾病特別是自身免疫性疾病發病機制的研究及療效觀察［2－3］，其準確性直接影響臨床診斷及療效觀察。目前對外周血本放置時間對T細胞亞群檢測結果的影響已有報道［4］，而對其活化標志的影響研究鮮見報道。本文對這一影響因素進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年4月本院健康體檢者10例的標本，其中男5例，女5例，平均年齡34歲。

1.2 儀器于試劑 Beckman Coulter公司FC500型流式細胞儀，熒光標準微球Flow－Check、CD45－FITC、CD3－PE－Cy5、CD69－PE、CD25－PE、HLA－DR－PE及同型對照均購自Immunotech公司。

1.3 方法 空腹采集健康體檢者靜脈血于EDTA－K2－抗凝管各2.0mL，充分混勻，室溫（20±5）℃及4℃冰箱保存。分別于采血后0、2、4、8、12、16、20、24h按常規方法用CD45－FITC/CD3－PE－Cy5/CD69－PE或CD25－PE、HLA－DR－PE標記并設同型對照；用熒光標準微球Flow－Check校準流式細胞儀的光路和流路，用同型對照設定陽性域值后檢測，每份樣本均檢測并分析10 000個細胞，記錄各抗原表達的百分率。

1.4 統計學處理 使用SPSS12.0統計軟件包進行統計學分析，各抗原表達的百分率以表示，組間比較常用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

EDTA－K2－抗凝室溫保存不同時間CD69、CD25、HLA－DR表達見表1。與0h相比，CD3＋CD69＋細胞表達百分率在12h開始減低，到16h明顯減低（t＝2.57，P＜0.05），CD3＋CD25＋到20h明顯減低（t＝3.18，P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細胞表達逐漸增高，到20h時明顯增高（t＝2.87，P＜0.05）。4℃保存不同時間CD69、CD25、HLA－DR表達見表2。與0h相比，4℃放置的標本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋表達到24h時明顯減低（t＝3.47，t＝3.25，P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細胞表達到24h的變化無統計學意義（t＝0.27，P＞0.05）。

表1 室溫保存不同時間CD69、CD25、HLA－DR表達（，%）

＊P＜0.05，與0h比較。

保存時間 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DR＋0h 0.74±0.27 3.42±0.53 4.82±0.95 2h 0.75±0.26 3.39±0.58 4.88±0.94 4h 0.79±0.25 3.46±0.52 4.86±0.94 8h 0.79±0.24 3.47±0.54 4.87±0.95 12h 0.63±0.21 3.32±0.52 4.94±0.94 16h 0.47±0.17＊3.05±0.53 5.31±0.98 20h 0.31±0.16 2.68±0.51＊6.04±0.94＊24h 0.21±0.05 2.04±0.39 5.23±0.51

表2 4℃保存不同時間CD69、CD25、HLA－DR表達（，%）

保存時間 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DA＋0h 0.74±0.27 3.42±0.53 4.82±0.95 2h 0.76±0.27 3.41±0.55 4.83±0.96 4h 0.77±0.26 3.43±0.56 4.85±0.93 8h 0.79±0.26 3.45±0.55 4.84±0.94 12h 0.73±0.25 3.45±0.56 4.89±0.97 16h 0.69±0.26 3.40±0.57 4.88±0.96

續表2 4℃保存不同時間CD69、CD25、HLA－DR表達（，%）

＊：P＜0.05，與0h比較。

保存時間 CD3＋CD69＋CD3＋CD25＋CD3＋HLA－DA＋20h 0.62±0.21 3.21±0.48 4.91±0.93 24h 0.48±0.17＊2.92±0.31＊4.95±0.98

3 討 論

CD69被稱為活化誘導分子（AIM），早期活化抗原－1（EA－1）等，是C－型凝集素受體家族的成員。CD69是T淋巴細胞活化后最早表達的表面抗原，當其表達后，可作為共刺激信號促進T細胞進一步活化和增殖［5］。

CD25是IL－2R的α鏈，又稱IL－2Rα分子或Tac抗原，為細胞因子受體。它是T淋巴細胞表面表達相對較早的標記，是活化細胞具有的抗原，在與β、γ亞基結合后形成具有高親和力的IL－2R，IL－2R與IL－2結合后T細胞進入S期，完成克隆增殖。

HLA－DR是MHC－1Ⅰ類分子，具有高度多肽性，在調控抗原遞呈細胞激活T細胞活化程度和特異性中起重要作用，是T細胞活化晚期表達抗原［1］。

CD3是T淋巴細胞的特異性表面標記分子，分析CD3＋T淋巴細胞中CD69、CD25、HLA－DA表達率目前已廣泛應用于許多疾病特別是自身免疫性疾病（如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、Graves病）發病機制的研究、疾病的活動情況及療效的觀察等［6－8］。目前檢測CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DR＋常用流式細胞儀進行檢測，對標本處理要求嚴格，因此本文探討標本放置溫度和時間對檢測結果是否會有影響。

本組測定結果顯示，EDTA－K2－抗凝的外周血在室溫放置的情況下，CD3＋CD69＋細胞表達百分率在12h開始減低，到16h時明顯減低（P＜0.05）；CD3＋CD25＋到20h時明顯減低（P＜0.05）；CD3＋HLA－DR＋細胞表達逐漸增高，到20h時明顯增高（P＜0.05）。故建議，室溫放置的標本，對于CD3＋CD69＋的檢測應在12h內檢測，CD3＋CD25＋及CD3＋HLADR＋應在16h內檢測。

4℃保存放置的標本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋表達到24h時明顯減低（P＜0.05），CD3＋HLA－DR＋細胞表達到24h變化無統計學意義（P＞0.05）。故建議，4℃保存放置的標本CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋應在20h內檢測，CD3＋HLA－DR＋可在24h內檢測。

綜上所述，為了減少EDTA－K2－抗凝標本放置溫度和時間對CD3＋CD69＋、CD3＋CD25＋、CD3＋HLA－DR＋測定的影響，標本最好放置4℃保存，并在相應的時間內測定，以消除由此引起的實驗前誤差，為臨床提供更準確可靠的實驗數據。

［1］Rea IM，McNerlan SE，Alexander HD.CD69，CD25，and HLADR activation antigen expression on CD3＋lymphocytes and relationship to serum TNF－alpha，IFN－gamma，and sIL－2Rlevels in aging［J］.Exp Gerontol，1999，34（1）：79－93.

［2］ 趙永強，董中升，劉占舉.類風濕關節炎外周血和關節滑液中T細胞CD25CD69表達及意義［J］.醫藥論壇雜志，2007，28（3）：9－10.

［3］ 郭義龍，蔡翁義，蔡小丹，等.復發性生殖器皰疹患者外周血T細胞CD69和HLA－DR的表達［J］.中國麻風皮膚病雜志，2007，8（8）：667－669.

［4］ 汪鎏漪，宋建新.不同抗凝劑及標本放置時間對T淋巴細胞亞群檢測結果的影響［J］.醫學信息，2014，28（3）：138.

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［6］章毅英，黃先玫，康曼麗，等.CD69和CD25及HLA－DR在川崎病患兒外周血T淋巴細胞中表達的研究［J］.中華兒科雜志，2006，44（5）：329－332.

［7］馬晶波，李鋒，馮樹芳，等.系統性紅斑狼瘡患者外周血CD4＋CD8＋和CD22＋淋巴細胞活化分子CD69的表達［J］.中華風濕病學雜志，2003，7（2）：71－74.

［8］ 趙永強，董中升，劉占舉，等.類風濕關節炎外周血和關節滑液中T細胞CD25CD69表達及意義［J］.醫藥論壇雜志，2007，28（3）：9－10.

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.063

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1673－4130（2015）03－0420－02

2014－10－26）

△通訊作者，E－mail：songjianxin8＠126.com。